2015 Fiscal Year Research-status Report

骨髄間葉系幹細胞に発現する骨形成抑制因子の探求-再生医療への応用を目指して

Research Project

Project/Area Number	26462259
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	早乙女進一東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (20401391)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大川淳東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30251507) 吉井俊貴東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 講師 (50583754)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	骨髄間葉系細胞 / 骨形成抑制因子 / ノックアウト / 過剰発現
Outline of Annual Research Achievements	マイクロアレイで確認した継代とともに発現が亢進する遺伝子のうち、発現比上位5因子を候補として選択し、CRISPRシステムによるノックアウト細胞クローンとレンチウィルスベクターによる過剰発現細胞クローンの作成を行った。骨髄液から培養した初代培養の骨髄間葉系細胞（BMSC)は、遺伝子の導入効率も低く、またクローニング操作に耐え得るほどの寿命を有していないため、セルバンクより不死化したBMSCのクローンを3種類入手し、実験に用いた。候補として5種類の遺伝子すべてに関して、過剰発現クローンとノックアウトクローンの作成を試みたが、入手した不死化BMSCは3種類ともレンチウィルスによる遺伝子導入効率、リポフェクションによるCRISPRベクターの導入効率が低く、4種類の候補遺伝子に関しては、現在のところ過剰発現クローン、ノックアウトクローンともに確立できていない。1種類に関しては過剰発現に関しては入手した3種類のBMSCのうち2種類で、ノックアウトに関しては1種類の細胞で、それぞれクローンを確立した。入手した3種類の細胞に関して、上記のクローンの作成と同時に、骨分化能などに関する評価を行った。同じドナー由来の不死化BMSCではあるが、それぞれ細胞の形態、増殖速度などのキャラクターは大きく異なっていた。しかしながら、最も問題なのは、BMSCでありながら骨分化能が低いということである。当初は目的遺伝子を過剰発現させたり、ノックアウトさせた細胞自体に対する骨分化能の評価を進めていく予定であったが、現実的には共培養やコンディションドメディウムなどを使用して、他の細胞の骨分化能などに与える影響みていくことで、候補因子の骨分化抑制効果について評価していく必要があると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ノックアウト細胞や過剰発現細胞のクローニングに予定以上の時間を要している。
Strategy for Future Research Activity	ノックアウト細胞、過剰発現細胞ともに確立できていない4候補因子に関してもクローンの確立を進めてゆくが、すでに確立された1因子に関しては、共培養やコンディションドメディウムなどを用いて、骨分化能に与える影響について評価を進めてゆく。
Causes of Carryover	年度末の残額では希望商品が購入できなかった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度に消耗品費として執行予定。