ヒアルロン酸ネットワークと破骨細胞制御による骨転移治療の確立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462261
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 浦川 浩 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (60584753)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西田 佳弘 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50332698) ; 筑紫 聡 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座講師 (90378109) ; 小澤 英史 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (60635572) ; 生田 国大 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (40732657) ; 安藤 雄一 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (10360083)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 転移性骨腫瘍 / 破骨細胞 / ヒアルロン酸 / 骨修飾薬

Outline of Annual Research Achievements

各種癌細胞株の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワーク抑制の作用を明らかにするために、ヒト乳癌細胞のセルラインであるMDA-MB-231とマウス肺癌細胞のセルラインのルイス肺癌細胞を用いてヒアルロン酸合成酵素のmRNAやヒアルロン酸やヒアルロン酸合成酵素の蛋白発現の評価を行った。Particle Exclusion Assayを行い細胞外マトリクスの評価も実施した。各セルラインにおける細胞外、細胞周囲、細胞内のヒアルロン酸量をSandwich-ELISA法によるヒアルロン酸定量により評価した。各細胞株における細胞外マトリックスへの影響ついてParticle Exclusion Assay 、細胞自身のヒアルロン酸発現についてヒアルロン酸免疫染色を施行した。MDA-MB-231とルイス肺癌細胞において、ビスフォスフォネート製剤であるゾレドロン酸を用いた場合のCell viability assay (MTT)、Motility assayによる運動能、Invasion assayによる浸潤能、アポトーシスの評価を行った。各セルラインにおいてヒアルロン酸合成阻害薬4-methylumbelliferone(4-MU)とゾレドロン酸の共投与下のMTT、運動能、浸潤能、アポトーシスの評価を行った。また、CD44の免疫染色を行い4-MUやヒアルロン酸オリゴ糖投与後の各セルラインにおける発現の解析を行った。これらの実験により乳癌、肺癌のセルラインにおける細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークに対するヒアルロン酸合成阻害剤とゾレドロン酸の影響を評価した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

癌細胞の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークと骨転移治療薬やヒアルロン酸合成阻害薬、ヒアルロン酸オリゴ糖などによるそれらの変化を明らかにするために、各種癌細胞のセルラインを用いた実験を行ってきた。In vitroの実験においてヒアルロン酸合成阻害薬の4-MUは各癌細胞株の腫瘍増殖を抑え、運動能、浸潤能を抑制し、ゾレドロン酸など既存の骨転移治療薬による癌細胞の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークへの影響が評価できた。
当初の計画では破骨細胞分化させた培養骨髄細胞に対する4-MUの投与やヒアルロン酸合成酵素（HAS2）強制発現マウスとヒアルロニダーゼ（Hyal2）コンディショナルノックアウトマウスから採取し破骨細胞分化させた培養骨髄細胞を用いた実験を行う予定であったが平成26年度には実施できず進行が遅れている。平成27年度以降実施する予定である。また、In vivoの実験に準備に関しても若干進行が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

これまでの、基礎実験の結果を踏まえて、ヒアルロン酸を中心とした細胞外マトリックスの制御に焦点を当て、既存の骨転移治療薬への相互作用を明らかとし、臨床への応用を可能とするために、破骨細胞分化させた培養骨髄細胞やマウス骨転移モデルによる動物実験を進める。特に破骨細胞分化におけるヒアルロン酸合成阻害剤やヒアルロン酸オリゴ糖の影響について評価を行う。
ヒアルロン酸合成酵素であるHAS2強制発現マウスを用いゾレドロン酸やOPG－FcなどのRANKL阻害剤による骨転移増大に対する影響、生命予後の解析、ヒアルロン酸・ヒアルロン酸関連細胞外マトリックス分子・細胞膜上受容体発現の評価、破骨細胞数・分布への影響、組織標本の分子イメージングによる薬物分布の解析を野生型マウスとの比較において行う。ヒト骨転移組織検体を用い組織におけるヒアルロン酸量と破骨細胞数および分布の評価を予定である。

Causes of Carryover

破骨細胞分化させた培養骨髄細胞に対する4-MUの投与やヒアルロン酸合成酵素（HAS2）強制発現マウスとヒアルロニダーゼ（Hyal2）コンディショナルノックアウトマウスから採取し破骨細胞分化させた培養骨髄細胞を用いた実験を行う予定であったが遅れたため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後の使用計画として、1)マウスの骨転移モデルを用い、細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークに対する薬物（4-MU、ヒアルロン酸オリゴ糖など）と既存の骨修飾薬による影響を解析するため、マウス購入費用、薬剤の費用、免疫染色の抗体等購入費用に研究費を使用する。2) vitroでの薬剤の細胞内シグナル変化をmRNAレベルで解析するためプライマーおよびreal time PCRの試薬およびWestern blotのための抗体および試薬に対して研究費を使用する。3)研究結果の発表に関連する学会および論文校正費用、また研究に関連する書籍購入費用に研究費を使用する。