滑膜肉腫特異的融合遺伝子のin vivo機能解析及び創薬ターゲットの探索

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462264
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 濱田 健一郎 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50649043)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 王谷 英達 大阪大学, 医学部附属病院, その他 (60727965) ; 中 紀文 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90601964)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 滑膜肉腫 / 創薬 / 抗腫瘍効果

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株を用いてin vitro, in vivoで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果を時間制御下に厳密に評価し、融合遺伝子が創薬ターゲットとなり得るかを評価すること、更には融合遺伝子のin vitro, in vivoでの機能を評価することである。また、融合遺伝子抑制単独の抗腫瘍効果に加えて、融合遺伝子SS18-SSX抑制下での既存抗癌剤あるいは新規分子標的治療薬併用の抗腫瘍効果を評価することも可能である（Combined therapyの評価）。研究の進行は以下のように計画している。１）滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXの腫瘍原性の評価；ヌードマウスの動物実験モデルを用いてSS18-SSXが抑制された状態での腫瘍形成能を評価し、融合遺伝子SS18-SSXが腫瘍原性に与える影響を評価する。（微小転移に対する治療効果）。実際にはドキシサイクリンを投与した滑膜肉腫細胞をドキシサイクリン内服中のヌードマウスに摂取し、腫瘍の形成率を調査する。２）滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果の評価；ヌードマウスの動物実験モデルを用いて実際に形成されている腫瘍に対するSS18-SSX抑制の抗腫瘍効果を評価する。（既存の腫瘍に対する治療効果）。実際には滑膜肉腫細胞を摂取し、腫瘍形成したヌードマウスにドキシサイクリンを内服させ、腫瘍体積を経時的に調査し滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXを標的とした治療法の効果を評価する。３）融合遺伝子標的治療と他治療薬との治療相乗効果評価；ドキシサイクリンによる滑膜肉腫の抗腫瘍効果が確認された後、他治療薬との併用効果を評価する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株（YSSi, ASSi）を用いてin vitroで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果を確認した。YSSi、ASSiともにin vitroの培養系でドキシサイクリン投与群はドキシサイクリン非投与群と比較し有意に細胞増殖が抑制されていた。一方で、ドキシサイクリン誘導SS18-SSX遺伝子を導入していない親株では、ドキシサイクリン投与で細胞増殖に対する影響は認めなかった。次にin vivoでの融合遺伝子抑制による抗腫瘍効果を調査するためヌードマウスモデルでのドキシサイクリン投与実験を施行した。まず、YSSiを接種し腫瘍形成したヌードマウスにドキシサイクリンを内服させた後腫瘍組織を採取し、蛋白を回収した。ウエスタンブロット法にてSS18-SSXのタンパク発現がドキシサイクリン投与により抑制されていることを確認した。YSSiをヌードマウスに接種し10日後、触知可能な腫瘍形成した段階でマウスをドキシサイクリン内服群と非内服群とに群分けし、経時的に両群の腫瘍体積および体重を計測した。ドキシサイクリン投与群では非投与群と比較しマウスに形成された腫瘍体積の増殖が有意に抑制されていた。投与開始約1ヶ月でマウスより腫瘍を摘出し腫瘍重量を計測した。腫瘍重量はドキシサイクリン投与群でドキシサイクリン非投与群より有意に低く、ドキシサイクリン投与による抗腫瘍効果を認めた。マウスの体重は両群で有意差は認めなかった。以上の結果よりドキシサイクリン投与でSS18-SSXを抑制することによりin vitro, in vivoともに抗腫瘍効果が確認され、滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXが治療標的となり得ることが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

形成された腫瘍に対する滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXの抗腫瘍効果は確認できたので、今後はSS18-SSXが腫瘍原性に与える影響をin vivoで解析を行う。ドキシサイクリンを投与した細胞をヌードマウスに接種し、ヌードマウスにドキシサイクリンを内服させ経時的に腫瘍形成能を評価する。さらに腫瘍形成能を詳細に検討するため接種細胞数を漸減しながら同様の実験を行う。腫瘍原性にSS18-SSXが影響を与えているのならばドキシサイクリン投与群で腫瘍形成が抑制される結果が期待できる。もし腫瘍原性を抑制することが可能であれば、融合遺伝子標的治療は腫瘍切除後の再発・転移予防治療として有効であると考えられる。次に、YSSi株で確認された動物実験の結果をASSi株でも同様に行い、滑膜肉腫に対する融合遺伝子治療の再現性・一般性の検討を行う。最後に、既存または他の新規治療法と融合遺伝子標的治療の併用療法について検討する。既存治療薬群、ドキシサイクリン投与群、既存治療薬＋ドキシサイクリン群、コントロール群に群分けし投薬実験を行い融合遺伝子治療と既存治療の併用療法の抗腫瘍効果について検討する。また、融合遺伝子治療のメカニズムを解明するため、ドキシサイクリン投与による細胞シグナルの解析や、遺伝子変化の解析を行い、有効な併用療法の可能性についても合わせて検討を行う。有用な併用療法のターゲットが見つかれば、in vitro, in vivoで同様に融合遺伝子との併用療法の動物実験を行い新規治療法と融合遺伝子標的治療の有用性について検討を行う。

Causes of Carryover

in vivoでの融合遺伝子抑制による抗腫瘍効果を調査するためのヌードマウスモデルでのドキシサイクリン投与実験において想定よりも経費がかからなかったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

SS18-SSXが腫瘍原性に与える影響をin vivoで解析をより詳細に行うためのヌードマウス購入を予定している。