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2015 Fiscal Year Research-status Report

メカニカルストレス による軟骨細胞の miRNA発現のエピジェネティック制御

Research Project

Project/Area Number 26462299
Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

西田 圭一郎  岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80284058)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大橋 俊孝  岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50194262)
川畑 智子  岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (90600669)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsmicroRNA / 軟骨細胞 / メカニカルストレス / エピジェネティクス / ADAM12 / miR-29b / 新規疾患修飾性OA治療薬 / マイクロアレイ解析
Outline of Annual Research Achievements

初年度にはヒト軟骨細胞(Lonza社)を細胞伸展装置用チャンバー上で培養し、細胞伸展装置STB-140(STREX社製)を用いて伸展刺激(0.5Hz, 10%伸張, 30分、0.106Hz, 5%伸張, 30分)、またHDAC阻害剤を加えた後, 24時間でmiRNAを回収し、マイクロアレイを使用して網羅的なmiRNA発現の解析を行った。マイクロアレイには、EXIQON社のmiRCURY LNATM microRNA Arrayを用いた。コントロールと0.104Hz, 5%伸張, 30分の伸張刺激を与えた軟骨細胞では、miRNAの発現が2倍以上差を認めたものは約60種類、また伸張刺激を与えた群にMS-275(HDACクラスⅠ阻害剤)を添加したものでも約80種類のmiRNAの変動を確認した。
次年度にはメカニカルストレスで有意に発現が変動したもののうち,バイオインフォマティクスにより弱い刺激で発現が低下したmiR-29bのtarget geneの一つであるADAM12に着目した。ADAM12-LとADAM12-SはヒトにおけるADAM12の2つの主要なvariantであり, 弱刺激群と強刺激群は, 共に軟骨細胞においてADAM12-Lの発現が亢進し, miR-29bの発現は低下した。またADAM12-Sの発現はほとんど認めなかった。ATDC5細胞の軟骨分化過程において, 増殖期と肥大期でADAM12の発現の亢進を認めた。さらに手術中に採取したヒト変形性関節症の骨棘組織においても増殖軟骨細胞層と肥大軟骨細胞層でADAM12の発現を認め, 特に後者においてADAM12陽性細胞が有意に増加していた (p<0.01)。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度, マイクロアレイの実施に際し, 回収するRNA純度を高めていく過程に時間がかかった。メカニカルストレスによりmiRNAの発現が2倍以上差を認めた約60種類のmiRNAの中からmiR-29bに着目し, さらにバイオインフォマティクスによりmiR-29bのtarget geneの一つであるADAM12に絞り込んで解析することにより, 研究の遅れを取り戻すことができた。当院倫理委員会の承認を得て, ヒト変形性関節症での骨棘組織でのADAM12の発現, ATDC5細胞における軟骨細胞分化過程におけるADAM12の発現についても確認した。変形性関節症の病態において, メカニカルストレスによってmiR-29bの発現低下, ADAM12発現上昇が骨棘形成に関与している可能性が高いと考えており, さらに検討を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度はメカニカルストレスによるmiR-29bの発現抑制機序について, TGFβ, IGF-5など種々の成長因子を用いて検討する。また, miR-29bの強制発現, 阻害剤の使用によってADAM12発現に与える影響を検討する。さらにCRISPER/Cas-9システムによる遺伝子改変技術を用いてAMDM12遺伝子をノックアウトした細胞において, メカニカルストレスやmiR-29b強制発現の影響を検討する。最終段階としては当初の計画通り, HDAC阻害剤(エピジェネティクス関連薬)やJAK阻害剤を用いたmiRNAおよびAMAD12発現制御を目指す。

Causes of Carryover

マイクロアレイの実施に際し, 回収するRNA純度を高めていく過程に時間がかかった。メカニカルストレスによりmiRNAの発現が2倍以上差を認めた約60種類のmiRNAの中から有意なmiRNAを抽出する作業、さらに当該miRNAのtarget geneの絞り込みに時間を要し実験は進まなかった。また、target geneの絞り込み後、骨棘に注目し、手術時に採取した患者組織を使用するため、当院倫理委員会の承認を得るための時間を要した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

引き続き、ヒト正常軟骨細胞の購入および組織培養、RT-PCR, 蛋白解析に諸費用が必要である。また、成果を国内学会で発表するための旅費に使用する。

  • Research Products

    (5 results)

All 2015

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] 関節リウマチ-関節破壊の機序を中心に-2015

    • Author(s)
      原田遼三, 西田圭一郎
    • Journal Title

      リウマチ科

      Volume: 53 Pages: 227, 232

  • [Journal Article] Hyaluronan suppresses mechanical stress-induced expression of catabolic enzymes by human chondrocytes via inhibition of IL-1β production and subsequent NF-κB activation2015

    • Author(s)
      Ozawa M, Nishida K, Yoshida A, Saito T, Harada R, Machida T, Ozaki T
    • Journal Title

      Inflammation Res

      Volume: 64 Pages: 243,252

    • DOI

      10.1007/s00011-015-0804-2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 軟骨細胞. リウマチ性疾患における骨軟骨破壊に関わる細胞たち.2015

    • Author(s)
      西田圭一郎
    • Journal Title

      Keynote R.A

      Volume: 3 Pages: 113,116

  • [Presentation] メカニカルストレスに対するJAK阻害薬Tofacitinibの軟骨破壊抑制効果2015

    • Author(s)
      町田崇博、西田圭一郎、那須義久、中原龍一、堀田昌宏、竹下歩、兼田大輔、尾﨑敏文
    • Organizer
      第26回日本リウマチ学会中国・四国支部学術集会
    • Place of Presentation
      岡山市
    • Year and Date
      2015-12-04 – 2015-12-05
  • [Presentation] メカニカルストレスに対するJAK阻害薬Tofacitinibの軟骨破壊抑制効果2015

    • Author(s)
      町田崇博、西田圭一郎、那須義久、中原龍一、斎藤太一、堀田昌宏、竹下歩、兼田大輔、尾﨑敏文
    • Organizer
      第30回日本整形外科学会基礎学術集会
    • Place of Presentation
      富山市
    • Year and Date
      2015-10-22 – 2015-10-23

URL: 

Published: 2017-01-06  

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