2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462318
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
依田 昌樹 慶應義塾大学, 医学部, 特任助教 (30464994)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀内 圭輔 慶應義塾大学, 医学部, 特任准教授 (30327564)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ADAM10 / 骨・軟骨代謝 / シェディング / Notch / シグナル伝達 / 発生・分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度はII型コラーゲンプロモーター制御下でAdam10を欠損させたマウスモデル（A10/Col2マウス）を中心に表現系解析および遺伝子発現解析を行った。A10/Col2マウスはメンデルの法則に従って出生してくるが、離乳をさかいに死亡個体が目立ち8週齢まで生存する個体はわずかであった。またA10/Col2マウスは2週齡で顕著な体重減少を示し、長管骨は4週齡において有意に短縮していることが観察された。また組織学的観察からA10/Col2マウスは3週齢において二次骨化中心の出現が遅延していることが観察されたが、この現象は一過性であり8週齡の段階では野生型マウスと比較して差は見られなかった。軟骨細胞の増殖について検討を行ったところ、2週齢におけるBrdU取り込み試験において組織学的に有意な差は見られなかった。さらに新生仔から採取した肋軟骨細胞の増殖試験においても有意な差は見られなかった。また組織学的観察によりA10/Col2マウスの肥大軟骨細胞層の短縮が観察され、さらに肥大軟骨細胞の小型化も顕著であった。2週齢における膝軟骨の遺伝子発現解析にからNotchシグナルの下流分子であるHes1、Hey1、HeyLがA10/Col2マウスにおいて有意に低下していた。また軟骨最終分化マーカーであるMmp13の有意な発現低下がA10/Col2マウスにおいて観察された。
これらの結果から、A10/Col2マウスではNotchシグナルの低下によって軟骨細胞の最終分化に異常をきたし、重度な成長障害を呈することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は骨・軟骨形成におけるADAM10の制御機構を明らかにすることを目的としている。平成26年度、研究代表者らは軟骨分化におけるADAM10の関与について遺伝子改変マウスモデル（A10/Col2マウス）を使用して精査してきた。表現系解析および遺伝子発現解析から、A10/Col2マウスはNotchシグナルの低下から軟骨最終分化に異常が生じ、重度の成長障害をきたすことが示された。この研究成果は日本骨代謝学会および軟骨代謝学会にて発表を行った。これまで軟骨特異的にNotchシグナルを遮断させたマウスモデルはほとんどが胎生致死であり、今回得られたデータは出生後の軟骨代謝におけるADAM10もしくはNotchシグナルの関与を精査するために非常に有益なものであると考えている。一方で制御機構に関してはまだ精査する必要があると考えられるため、次年度以降計画に基づいて明らかにしてく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は引き続きA10/Col2マウスモデルの解析を行う。マイクロアレイ解析により膝軟骨の遺伝子発現を網羅的に評価し、得られた結果から特定の遺伝子発現の局在性をin situハイブリダイゼーション法を用いて解析する。また、骨形態計測もあわせて行い軟骨細胞分化だけでなく軟骨組織周辺の骨芽細胞および破骨細胞の動態を評価し成長障害の要因を精査する。
また、骨芽細胞におけるADAM10の関与を細胞分化および機能の点から解析する予定である。骨芽細胞特異的にAdam10を欠損させたマウスモデル（A10/Sp7マウス）を用いて表現系解析を行う。A10/Sp7マウスはTet-offシステムにより遺伝子発現を制御でき、成獣時において骨芽細胞特異的にAdam10を欠損させることが可能である。骨形成の評価はレントゲン解析、マイクロCT解析、病理組織観察によって行う。また、骨芽細胞は破骨細胞分化誘導能を有していることから、機能解析としてA10/Sp7もしくは野生型マウス由来の骨芽細胞を用いて破骨細胞分化誘導試験を行う。
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| Causes of Carryover |
未使用額の発生は効率的な物品購入を行った結果である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度はcKOマウスから採取した組織から遺伝子・タンパク質発現解析に必要な酵素および抗体の購入を予定している。また組織学的解析のために必要な蛍光標識抗体および初代培養細胞用の培養器具・試薬類の購入も行う。培養細胞の遺伝子ノックダウンに使用するsiRNAおよび導入試薬の購入も必須であると考えている。組織特異的なADAM10欠損マウスの維持および交配計画のため、cKOマウスのジェノタイピング用試薬の購入が必要である。
平成26年度の未使用額は平成27年度以降の消耗品費にあてる予定である
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