吸入麻酔薬が幼若ラット海馬歯状回の顆粒細胞移動に及ぼす影響

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462325
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 橋本 聡一 北海道大学, 大学病院, 講師 (40281810)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 吸入麻酔薬 / 学習記憶障害 / 海馬歯状回 / 顆粒細胞移動 / イソフルラン / セボフルラン

Outline of Annual Research Achievements

7日齢のラットに吸入麻酔薬を負荷した場合に，海馬歯状回の新生顆粒細胞の移動に変化が生じるか検討した。
6日齢のWistarラットにBrdUを300 mg/kg皮下注射することにより，BrdU投与後に分化した細胞を標識した。BrdU投与20時間後（7日齢）に1％および2%イソフルラン，3％セボフルラン，および50%酸素＋12％二酸化炭素混合ガスを2時間負荷した。対照群は空気に2時間暴露した。各群N=6とした。ガス負荷の直前（空気群のみ），ガス負荷の2時間後（BrdU投与24時間後），14，21，28，35および70日齢でラットをパラホルムアルデヒドで潅流固定し，脳を摘出した。
摘出した脳からクリオスタットを用いて海馬の冠状断凍結切片を作成し，抗BrdU抗体と抗Prox1抗体を使用して蛍光二重染色を行った。二重染色された細胞核は6日齢に新生した顆粒細胞を示す。共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて，各標本から6-10切片を選び，切片を1μm間隔でスキャンし，z軸スタック画像を作成し，歯状回顆粒細胞層と歯状回門で，それぞれ二重染色された細胞数を計測した。顆粒細胞層に存在するものは正常に移動を完了したものであり，歯状回門に存在するものは移動が抑制された異所性の顆粒細胞である。
2％イソフルラン群と3％セボフルラン群では，空気負荷群と比較して，21日齢以降，有意に異所性の細胞数が多かった。1％イソフルラン群、二酸化炭素負荷群では，21日齢における異所性細胞数は空気負荷群と比較して有意差を認めなかった。
以上から7日齢で１MACの吸入麻酔薬（2%イソフルランおよび3％イソフルラン）を負荷すると，その後の成長過程における海馬歯状回の顆粒細胞の移動が阻害されることが明らかとなった。これは吸入麻酔薬による成長後の学習・記憶障害の機序を説明し得る新たな知見と思われる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ほぼ当初の計画通りの進行である。2％イソフルランと3％セボフルラン負荷の結果から、21日齢での比較が重要であることが判明したので，一部の群（1％イソフルラン、二酸化炭素負荷）では、ガス負荷の2時間後，14，21，28，35および70日齢のすべてで比較することはせずに、21日齢のみで対照群と比較した。一方、当初は27年度に予定していた14日齢での2％イソフルラン負荷はすでに実施した。

Strategy for Future Research Activity

当初の予定通り，吸入麻酔薬による顆粒細胞移動抑制の機序について明らかにする。まず吸入麻酔薬負荷前後にGABAA受容体拮抗薬のピクロトキシンを投与すると、顆粒球移動は正常化するかを明らかにする。正常化するなら仮説の通り、吸入麻酔薬の持つGABAA受容体作動薬としての作用が原因であるといえる。また、幼若期にはCl-トランスポーターの分布が成体と異なりNKCC1 > KCC2となっているため、GABAA受容体を介したGABAの作用は成体とは逆に興奮性となるとされており、これが顆粒細胞移動に関わっていることも考えれるので、NKCC1抑制作用をもつブメタニドを前投与した上で吸入麻酔薬を負荷すると、顆粒球移動の移動は正常化するかを明らかにする予定である。

Causes of Carryover

実験動物の必要数が当初の見込みより少なかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度以降の実験動物購入に充てる予定。