2015 Fiscal Year Research-status Report
D-アミノ酸オキシダーゼが脊髄侵害受容性シナプス伝達に与える影響
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26462346
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
高薄 敏史 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (80348052)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Dアミノオキシダーゼ / サブスタンスＰ / c-Fos |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、NK１受容体internalizationの評価を行った。
ICRマウス足底部に2.5％ホルマリンを皮下注し、侵害受容性疼痛モデルを作製、ペントバルビタール麻酔下に4%パラホルムアルデヒドによる灌流固定を行い、取り出した脊髄を一晩後固定、OCTに包埋し、クリオスタットで30μmの厚さにスライスし、１次抗体として抗NK１受容体抗体ポリクローナル抗体を、２次抗体としてAlexa488、594を用いて免疫組織染色を行い、後角表層（lamina I）におけるNK1 internalizationの評価を行った。ホルマリン皮下注をした同側脊髄後角において内在化を示すニューロンを多数認め、第１次求心性線維からのサブスタンスP放出の増加を確認した。しかしながら内在化を認めない、あるいはごく少数しか認めない標本も多く、現段階ではコントロール群の評価には至っていない。原因として、以前、この実験で使用していた１次抗体が製造中止となったため、他の抗体で代用しているためと考えられる。現在、様々な抗体を使用して染色を行っている最中である。
一方、現在、c-Fosの評価を行っており、2.5%ホルマリンを後肢に皮下注し、２時間後、ペントバルビタール麻酔下に灌流固定を行い、抗Fosポリクローナル抗体を、２次抗体としてAlexa488、594を用いて蛍光発色による染色を行っている。この方法により、一部、c-Fosの発現を認めたが、ごく少数であり、まだ発現量の評価には至っていない。今後、ABC（avidin biotinylated enzyme complex）法を用いた染色を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１次抗体の製造中止など、想定外の状況により、別の抗体による免疫染色を余儀なくされている。またc-Fosの染色に関しても、評価には至っておらず、実験の進捗状況としてはやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、本学生理学教室の免疫染色専門の先生に助言を仰ぎながら実験を行っている。さらに別の１次抗体を購入検討しており、それらを使用する予定である。また、本研究について協力を要請しているTony L.Yaksh教授にも相談する予定である。
またc-Fos発現の評価については、当講座に、ABC法によるc-Fos染色を経験したことがある助教がおり、そちらに相談する予定である。
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| Causes of Carryover |
計画していた国際学会に参加しなかったため。また実験に必要な薬品等の消費が予想より少なく、予定していた薬品購入を行わなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度、国際学会などの発表を行う予定である。また薬品等消耗品の購入も必要と考えられる。
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