周術期抗血小板薬薬効モニタリングのための血小板由来microRNA発現解析の検討

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462370
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 中山 力恒 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90568198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐和 貞治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10206013) ; 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50239266) ; 小川 覚 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50636131) ; 中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: micro RNA / 血小板

Outline of Annual Research Achievements

本年度も、昨年度の研究を継続した。血小板、マイクロパーティクル、血漿、多血小板血漿、乏血小板血漿のサンプルを作成し、各サンプルにおけるmiRNAの発現を網羅的に解析し、血小板に対して最も鋭敏なmiRNAを同定することを目標に研究を進めた。
具体的にはクエン酸採血後、ADP, Thrombinを負荷することで血小板刺激を行い、負荷前後の全血検体を、遠心操作にて多血小板血漿作成後、洗浄血小板溶液を作成した。また、乏血小板血漿を作成後、超遠心にて、マイクロパーティクルペレットを作成した。そして、それらのサンプルに対して、miRNAの分離・濃縮を行った。その後、バイオアナライザーを用いて、サンプルからmiRNA群が抽出されていることを確認後、small RNAのライブラリ作成（Ion total RNA-seq kitを用いたフラグメント化）し、cDNAに変換を行った。さらにエマルジョンPCR法を用いて、cDNAを増幅させ、シーケンシングに持ち込んだ。本年度は、Ion Chefを後半から導入したことで、昨年度不安定であったサンプルの抽出～シーケンサーの立ち上げが比較的安定し、有意差は、未だ認められないものの、サンプルサイズの増加で、有意差が確認できるであろうと考えられる段階である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

サンプル抽出、シーケンサーの立ち上げには比較的安定してきたものの、前年度の遅れを取り戻すまでには、至っていない。

Strategy for Future Research Activity

手技が安定してきたため、サンプル抽出回数を可能な限り、増加させたいと考えている。

Causes of Carryover

前年度よりも、スピードアップしたものの、やはり当初の計画よりも、チップ使用等が少なかったことが最大の原因である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

シケーンスの試行回数を増加させることで、高額なチップや試薬代として使用する。また、Ion chefに関する試薬も高価であり、その費用も充てる予定である。