The efficacy of using microRNAs in platelets as a method of platelet function monitoring based on next-generation sequencing

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26462370
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 中山 力恒 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90568198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐和 貞治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10206013) ; 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50239266) ; 小川 覚 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50636131) ; 中嶋 康文 関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: microRNA / 血小板

Outline of Annual Research Achievements

本年度も昨年度の研究を継続した。血小板、マイクロパーティクル、血漿、多血小板血漿、乏血小板のサンプルを作成し、各サンプルにおけるmicroRNAの発現を網羅的に解析し、血小板に対して最も鋭敏なmicroRNAを同定することを目標に研究を進めた。
具体的には、クエン酸採血後、ADP, Thrombinを負荷することで血小板刺激を行い、負荷前後の全血検体から遠心操作にて多血小板血漿作成後、洗浄血小板溶液を作成した。また、乏血小板血漿を作成後、超遠心にてマイクロパーティクルペレットを作成した。そして、それらのサンプルに対して、microRNAの分離・濃縮を行った。その後、バイオアナライザーを用いて、サンプルからmicroRNA分画が抽出されていることを確認後、small RNAのライブラリ作成(Ion total RNA-seq kitを用いたフラグメント化）し、cDNAに変換を行った。さらにエマルジョンPCR法を用いて、cDNAを増幅させ、シーケンシングに持ち込んだ。昨年からIon Chefを導入したことで、実験一連の流れが安定した。やはり、乏血小板血漿やマイクロパーティクルのサンプルからの、microRNA分画の収量がシーケンシングに満足できる量でない場合が多々あった。しかし、収量の多いサンプルをduplicateする工夫を加え、現段階で、いくつかのmicroRNAの発現に差が認められる段階に至っている。