2015 Fiscal Year Research-status Report
脳幹からの下行性抑制ニューロンは脊髄後角の深層ニューロンを興奮させる
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26462386
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| Research Institution | Kansai University of Health Sciences |
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Principal Investigator |
樫葉 均 関西医療大学, 看護学部, 教授 (10185754)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 脊髄後角 / 侵害情報 / 動物実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊髄後角は大きく表層（Rexedの分類：Ⅰ－Ⅱ層）と深層（Ⅲ－Ⅵ層）に大別することができ、侵害受容ニューロンは後角表層に、非侵害受容ニューロンは深層に終末している。一般的にこのような事実から、侵害情報は後角表層で、非侵害情報は深層でそれぞれ情報処理されると考えられてきた。加えて、脳幹からの下行性抑制系ニューロンもまた表層ニューロンと深く関わっていると信じられてきた。しかしながら、このような考えは、侵害受容ニューロンに含まれる修飾物質、サブスタンスPの受容体が深層ニューロンに発現していることが発表されて以来、徐々に修正を余儀なくされてきた。我々はこのような脊髄後角の神経機構の解明に電気生理学的および形態学的実験手法を用い、特にこれまで非侵害情報を取り扱うと思われてきた脊髄深層に注目し、深層ニューロンの侵害情報への関与について検討を進めてきた。脊髄後角は、末梢から中枢への電気信号の中継所（Relay station）という位置づけだけにとどまらず、感覚情報を修飾・加工する仕組みの存在が示唆されている。そのため、脊髄後角には微少神経回路（Microcircuit）や脳幹をも巻き込んだ局所神経回路（Localcircuit）を形成しており、その中心的役割を果たすのは、これまでの実験成果より深層ニューロンであると考えている。深層ニューロンには、興奮性の投射ニューロン、および興奮性と抑制性の介在ニューロン、下行性ニューロンには、セロトニン作動性ニューロンとノルアドレナリン作動性ニューロンが存在し、これらの関わり方について仮説を提唱しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでの研究実績の概要については上で述べたが、その研究実績の主軸を支えてきたのが、最近、生理学者のあいだで広く用いられているブラインドパッチクランプ（Blind patch-clamp recording techniquse）法である。この方法は、従来の細胞内電極法（Intracellular recording techniques）に比べ、比較的簡便に感度良く単一ニューロンの膜電流を記録できるところにある。
ラットの新鮮脊髄スライス標本を作製し、脊髄後角における深層ニューロンをターゲットに、サブスタンスPやエンケファリン（代表的なオピオイドペプチドの一つ）、また、セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン）やノルアドレナリンとその作動薬（アゴニスト）などの物質を用い膜電流解析を行っている。これまで、深層ニューロンの多くはサブスタンスPに対し興奮性に応答し、このニューロン群のほとんどは、同時にエンケファリンに抑制的に反応する。つまり、深層ニューロンの多くは侵害情報を受け取りながら、エンケファリンを含有する後角介在ニューロンにより制御されることを意味する。また、サブスタンスPに応答するニューロンの約半数はセロトニンやノルアドレナリンンにも応答し、これらの応答の多くは興奮性のものであった。従来、下行性のセロトニン作動性およびノルアドレナリン作動性ニューロンは、表層ニューロンを活動を抑制すると考えられてきた。しかしながら、我々の成果は侵害受容性の深層ニューロンを興奮させるというものであった。一方、侵害受容性の深層ニューロンの生理学的特質の解析については、実験計画通りに進んでいないのが現状である。これについては、以下の「今後の研究の推進方策」で述べる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果より、大まかな局所神経回路の構図が浮かび上がってきた（上述）。深層ニューロンに発現しているセロトニンやノルアドレナリンに受容体のサブタイプについても明らかになりつつある。我々が現時点において最も重点的に取り組まなければならないのは、サブスタンスPやセロトニン、ノルアドレナリンに感受性を示す深層ニューロンの生理学的特質に関する検討である。このニューロンは、①投射性の興奮性ニューロン、②介在性（局所性）の興奮性ニューロン、もしくは介在性（局所性）の抑制性ニューロン、のいずれかであると考えられる。したがって、今我々が行っているパッチクランプのレコーディングにおいて、記録しているニューロンが、興奮性の、あるいは抑制性の入力（それぞれ、EPSCsとIPSCs）を受けているが、このニューロンそのものが興奮性ニューロン、あるいは抑制性ニューロンでのいずれかを検討することは簡単ではない。これまで、膜電流を測定している単一ニューロンを標識し、その後、免疫組織化学法で伝達物質等の抗体を用い二重染色することで、これを解決しようと試みてきたが、今のところ成功していない。そこで、In Situ ハイブリダイゼーション法を用いて、サブスタンスPの受容体であるNeurokinin-1 Receptor （NK１R）の遺伝子発現を手がかりに、これと共発現しているは、グルタミン酸（興奮性の伝達物質）の小胞トランスポーター（vesicular glutamate transporter 1/2；VGLUT1/2) 、あるいはGABA/グリシン（抑制性の伝達物質）の小胞トランスポーター（vesicular inhibitory amino acid transporter ；VGIAAT)であるのか、検証する予定である。これを突破口にして、この研究を飛躍させたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
「現在までの進捗状況」で述べたとおり、当初の実験計画通りに成果が得られていない部分が生じている。これまで、パッチクランプ法にて脊髄後角の単一ニューロンの膜電流を記録した後に、その単一ニューロンを形態学的に同定し、更にその後、免疫組織化学法により神経伝達物質等の検出を試みてきた。しかしながら、この実験はいくつかの点で困難であることが分かってきた。最大の理由は、膜電流の記録後、ニューロンからピペット電極を外す際にニューロンが障害を受け生き残れないケースが多いことである。よって我々は、In Situ ハイブリダイゼーション法を用いて別の角度から解析することを計画し、準備しているところである。このように部分的な計画の修正が生じ、使用額が変更となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
In Situ ハイブリダイゼーション法は、パラホルムアルデヒド等で固定した細胞において、それに含まれるメッセンジャーRNA（ｍRNA）を検出する方法である。パッチクランプ法では脊髄後角深層のニューロンの多くが侵害受容ニューロンに含有されるサブスタンスPに対して興奮性の内向き電流を発生させる。更に、深層ニューロンで記録できるEPSCsやIPSCｓは、グルタミン酸の受容体、およびGABA／グリシンの受容体のアンタゴニストで完全にブロックされる。したがって、サブスタンスPの受容体であるNK1Rの遺伝子を発現するニューロンが、上で述べたVGLUT1/2 とVGIAATのどちらの遺伝子と共存しているのかをIn Situ ハイブリダイゼーション法を用いて検討する予定である。
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