2014 Fiscal Year Research-status Report

伸展刺激における膀胱上皮から排尿筋・DRGへの細胞間シグナル伝達機構の解明

Research Project

Project/Area Number	26462437
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	望月勉山梨大学, 総合研究部, 医学研究員 (50377496)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	排尿生理 / 求心性伝達 / 膀胱上皮 / 膀胱平滑筋 / DRG
Outline of Annual Research Achievements	これまでの研究でマウス膀胱上皮細胞は伸展刺激に応答し、ATP 放出を行うことが確認された。我々は「蓄尿時の膀胱伸展→ 膀胱上皮が伸展刺激を感知→ ATP などの mediator を放出→ 求心性神経や排尿筋にシグナル伝達」という仮説を立て、尿意のメカニズムや排尿筋過活動の病態解明に向け精力的に研究を続けている。 1.マウスから膀胱上皮細胞・平滑筋細胞・DRG 細胞をそれぞれ酵素処理にて単離し、培養細胞系を樹立。膀胱上皮細胞および DRG 細胞は初代培養細胞のみをその都度作成し、以後の実験に用いる。膀胱平滑筋細胞については継代が可能なため、cell line として用いる。2.各種培養細胞に対し形態的ならびに機能的な発現に問題がないかどうかを遺伝子レベル・タンパクレベルで再確認。具体的には CK7(上皮マーカー)・α-SMA（筋性マーカー）・S-100（神経マーカー）を各々RT-PCR 法や免疫染色（蛍光抗体法）でそれらの発現を確認している。3.ストレッチチャンバー上に膀胱上皮培養細胞を播種させ、伸展刺激を加える前と後でのチャンバー内 solution に含まれる物質について、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で成分分析を実施し、定量化を行い、刺激前後での神経伝達物質を解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason PCRや免疫染色などの生化学的実験はほぼ終了しているが、伸展刺激での生理実験データがいまだ不十分。理由として、各種培養細胞の状態が未だ安定しておらず、再現性のあるデータが得られていない。今後の対策として、培地を変更するなど諸条件を整えていくよう検討中である。
Strategy for Future Research Activity	次年度以降は、本実験として平滑筋培養細胞ならびに DRG 培養細胞が、上皮から放出されたmediator にどのように応答するかを電気生理学的解析により検証する。また、前年度までに得られた予備実験でのデータを参考にし、予想された mediator に対しノックダウン法や各種inhibitor を適宜用いて、それらの効果についても同様に検討していき、最終的には上皮から放出された伝達物質のうち、平滑筋や DRG に対してそれぞれ何が最も重要な役割を担っているのかを明らかとする。
Causes of Carryover	新規物品購入費が当初の見積りよりも安価に抑えられたため、上記のような繰越金が生じる結果となった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度以降は、当初の予想より、より多くの消耗物品が必要と見込まれるため、当該繰越金にて補填する予定である。