2015 Fiscal Year Research-status Report
蝸牛感覚上皮の組織構築とバリア機能－頂側結合の役割に関して－
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26462563
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
坂口 博史 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00515223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮下 武憲 香川大学, 医学部, 准教授 (60363214)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | トリセルリン / タイト結合 / 難聴 / 有毛細胞 / 内リンパ電位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はtricellulin KOマウスを作製し、tricellulinの生体における機能を調べるとともにDFNB 42 の病態の解明を試みた。tricellulin遺伝子のexon2を欠失させることで、KOマウスを作製した。tricellulinは全身のあらゆる臓器に発現しているにもかかわらず、tricellulin KOマウスの外観、出生や発達に明らかな異常は見られなかった。ABRでWTやHEマウスは正常聴力を示したが、KOマウスは無反応であった。一方で、KOマウスのEPは正常に保たれていた。次に有毛細胞形態を経時的に確認したところ、P12までは有毛細胞に明らかな異常は認めなかったが、EPが急激に上昇してくる時期に相当するP14で外有毛細胞が消失していた。次にコルチ器の器官培養を行ったところ、P4で採取したコルチ器はP16まで有毛細胞の脱落がほとんど見られず、このことから外リンパ液と類似した培養液中では有毛細胞死は起こらないことが判明した。以上の結果から、tricellulin欠失によりイオンの透過性に軽微な変化が生じ、EPは正常に保たれるものの、内リンパ腔の高濃度K＋がEPをdriving forceとして細胞の側底面にリークすることで有毛細胞死が生じていると予想された。本研究成果の一部は国内外の学会で発表し、英文学術誌に掲載された１）。今後はtricellulinによる細胞側底面のイオン濃度変化を測定し、上述の有毛細胞死のメカニズムについて確認するとともに、EPの変化を軽減することで有毛細胞死を防ぐ新たな治療的アプローチが可能かどうかという点について研究を進める予定である。
１）Kamitani T et al. Sientific Report 5, 2015
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はtricellulin KOマウスを作製し、tricellulinの生体における機能とDFNB 42 の病態について一定の解明に至った。tricellulin KOマウスの外観、出生や発達には明らかな異常は見られなかったが、この点も特定のタイト結合の機能不全による全身的影響に関する一定の知見を与える結果であると言える。生後21日(P21)の時点でABRおよびDPOAEを用いて聴力を測定したところ、KOマウスは無反応であったことから、ヒト遺伝性難聴のモデルとして用いることができることも確認された。コルチ器における有毛細胞の経時的変化については、生後の各段階での解析を終えており、形態学的な有毛細胞死の進行が確認された。内リンパ電位が成熟するP14以降で外有毛細胞の消失を認めたことは内リンパ電位の上昇と細胞死の間に何らかの因果関係があることを示唆しており、この点は今後さらに細胞内外のイオン組成に関する測定を行うことで解明が進むと考えられる。さらに、コルチ器の器官培養による細胞生物学的アプローチも応用し、外リンパ液と同様のイオン組成においては有毛細胞死が生じないことから、細胞外イオン環境の変化が細胞死に影響している可能性を示唆することができた。このような結果は内耳機能の解明のみならず細胞生物学全般にインパクトをもたらす結果であると言える。現時点では、内リンパ腔のK＋が上昇したEPをdriving forceとして細胞側底面にリークする機序は細胞死に関わる有力な病態モデルと考えられる。今後このモデルをさらに検証し、内リンパ電位の変化と細胞死の関連を解明することにより、遺伝性難聴における有毛細胞死を予防する新たな治療アプローチにつながると期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究においては、１）細胞間接着関連分子の局在解析、２）TTJ のストランド構造の解析、３）内リンパ電位低下モデルによる有毛細胞死抑制の検証を中心に行う。細胞間接着関連分子の局在解析については、TRIC-KO マウスおよび野生型マウスの蝸牛上皮を用いて、既にTJJ に局在することが知られるLSR、ILDR1、ILDR2 のような分子や、細胞接着関連分子であるZO-1/2/3、occluding、MAGI-1、P120、VAP33、α/β-catenin などの免疫染色を行う。上記の解析は内耳以外に胃、小腸、腎臓でも行い、内耳との違いを検証することで、TTJ の特性に関する内耳特有の要素を探る。TTJ のストランド構造の解析については、TRIC-KO マウスと野生型マウスの蝸牛上皮細胞からフリーズフラクチャー(FF)レプリカを作製し、特に蝸牛感覚上皮と血管条のTTJ に注目してTEM で観察する。胃、小腸、腎臓の上皮でも同様のサンプルを作製し、TTJ の形態について内耳と比較する。一部の内耳サンプルでは、FF レプリカをTTJ 複合体構成分子の抗体で染色し、標的分子の細胞内局在の詳細を調べる。内リンパ電位低下モデルによる有毛細胞死抑制の検証については、内リンパ電位を低下させることが知られる薬剤を内耳に還流し、有毛細胞死が抑制できるかどうかを検証する。薬剤の投与は浸透圧ポンプを用いて行い、生後早期から持続的に薬剤還流を行ったのちにコルチ器を採取し、有毛細胞の脱落をカウントする。本実験によって器官培養の系と同様に有毛細胞の脱落が現象するなら、生体における内耳機能障害の予防につながる画期的な成果が得られると考えられる。
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| Causes of Carryover |
当該研究に必要な物品（聴力検査に用いるABR用機器の追加物品）の一部が販売中止となったため、代替品を購入することにした。これによって価格が当初予定価格より高くなったため、本年度残金のみで支払いができず、次年度の助成金交付をまって納入することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の助成金の一部と併せて物品の購入に充てる。
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Research Products
(1 results)
