2014 Fiscal Year Research-status Report
次世代シークエンサーを用いたわが国の網膜色素変性患者の遺伝子診断システムの構築
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26462659
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
堀田 喜裕 浜松医科大学, 医学部, 教授 (90173608)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 修一 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20230550)
寺崎 浩子 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40207478)
細野 克博 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60402260)
高橋 政代 独立行政法人理化学研究所, 発生・再生科学総合研究センター網膜再生医療研究チーム, チームリーダー (80252443)
蓑島 伸生 浜松医科大学, メディカルフォトニクス研究センター, 教授 (90181966)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 網膜色素変性 / 遺伝子変異解析 / 次世代シークエンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
網膜色素変性(Retinitis Pigmentosa; RP)は、失明に至る遺伝性、進行性の疾患群であり、網膜を原発性、びまん性に障害する。RPは常染色体優性遺伝(ad)、常染色体劣性遺伝(ar)、X連鎖性遺伝形式が知られる。これまでに60個以上の原因遺伝子が同定され、遺伝的異質性が知られている。
我々は、日本の基幹施設からarRP患者を収集し、arRP原因遺伝子の大規模スクリーニングを行い、日本人RP患者に高頻度に認められる原因遺伝子を発見した(Hosono et al., PLoS One 2012)。わが国では、EYS (Eyes Shut Homolog)遺伝子検索により、18～26%のarRPの原因遺伝子の同定が可能である。本研究はこの研究成果をさらに発展させ、日本人RP患者を効率よくスクリーニングできる遺伝子診断システムの構築を目的とする。
本年度の研究計画は以下(1)、（2）を計画した。
(1)RP患者の検体とバックアップ体制, (2)原因遺伝子の変異探索。
（1）については、すでに206人のRP検体が収集済であるが、家族の協力が得られる場合には家族の検体を収集した。また、必要に応じて眼科的検査も光干渉断層測定や自発蛍光検査を追加した。(2)については、浜松医科大学眼科を受診した双子のレーバー先天盲（Leber Congenital Amaurosis; LCA）患児に対して原因遺伝子を同定するために次世代シークエンサーを用いて変異探索を行った。結果、双子の患児からGUCY2D遺伝子に疾患原因変異の可能性が高い新規のスプライス変異 (c.2113+2_2113+3insT)と新規のミスセンス変異(p.L905P)を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、より効率の良い日本人RP患者の遺伝子診断を行うために次世代シークエンサーを使用した変異探索法の検討を行った。使用機器は、次世代シークエンサーMiSeq (イルミナ社)を使用した。変異解析する遺伝子は、遺伝性の網膜関連疾患の原因遺伝子データベースRetNet (https://sph.uth.edu/retnet/home.htm)を参考にして74個のRP またはLCAの原因遺伝子を選択した。まずは、作成したライブラリーの検証を行うため、既に原因変異を同定しているRP患者(RP10H)を用いてターゲットシークエンス解析を行った。RP10Hは既にSanger法により2種のUSH2A遺伝子変異(p.G229R, p.R926C)を同定している(Zhao et al., Journal of Human Genetics. 2014)。結果、原因変異候補としてSanger法で同定した変異と同じUSH2A遺伝子の2種の原因変異を検出した。次に、原因遺伝子が未同定のLCAの双子の患児に対して同手法を用いて解析を行い、LCAの原因遺伝子の１つであるGUCY2D遺伝子に疾患原因変異の可能性が高い新規のスプライス変異 (c.2113+2_2113+3insT)とミスセンス変異(p.L905P)を同定した。得られた2種の変異はサンガー法で確認実験を行った。また、両親の検体を得て、分離解析を実施出来た。
日本人のLCA患児におけるGUCY2Dの遺伝子変異報告は本発表が最初の報告であり、研究目的の達成度はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度の研究計画は本年度の（１）、（２）を引き続き行い、新たに（３）遺伝子変異と表現型の検討も行う。
（２）については収集した206人のarRP患者の内、100人についてEYS遺伝子とUSH2A遺伝子の全エクソンに対して変異解析を行い、EYS遺伝子より18人(Hosono et al., PLoS One 2012)、USH2A遺伝子より4人から疾患原因変異を同定している(Zhao et al., Journal of Human Genetics 2014)。次年度は、原因変異が未同定の患者について次世代シークエンサーを用いた変異探索を開始する。（３）については、遺伝子解析結果をもとに、原因遺伝子の変異部位と臨床症状との関連を検討する。これらデータを蓄積し、我が国のRP患者における原因遺伝子変異と病態の対応関係の基盤データを作成する。
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| Causes of Carryover |
研究消耗品の調達に際し、予定額より安価で購入出来たため50,000円の繰越金が生じた。当該繰越金については次年度の研究消耗品に充てる予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本研究では、PCRダイレクトシークエンス法と次世代シークエンサーを用いてRP原因遺伝子の変異解析を行う。当施設には既に必要な設備は整っているため、主な消耗品はシークエンシングに用いる試薬である。
平成26年度の成果報告を第119回日本眼科学会（北海道）、第69回日本臨床眼科学会（名古屋）、ARVO2015（米国）等で参加発表を行うための旅費として使用する。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] The first USH2A mutation analysis of Japanese autosomal recessive retinitis pigmentosa patients: a totally different mutation profile with the lack of frequent mutations found in Caucasian patients.2014
Author(s)
Yang Zhao, Katsuhiro Hosono, Kimiko Suto, Chie Ishigami, Yuki Arai, Akiko Hikoya, Yasuhiko Hirami, Masafumi Ohtsubo, Shinji Ueno, Hiroko Terasaki, Miho Sato, Hiroshi Nakanishi, Shiori Endo, Kunihiro Mizuta, Hiroyuki Mineta, Mineo Kondo, Masayo Takahashi, Shinsei Minoshima, Yoshihiro Hotta.
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Journal Title
J Hum Genet.
Volume: 59
Pages: 521-528
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] The first USH2A mutation analysis of Japanese Autosomal Recessive Retinitis Pigmentosa patients: A totally different mutation profile with the lack of frequent mutations found in Caucasian patients2014
Author(s)
Katsuhiro Hosono, Yang Zhao, Kimiko Suto, Chie Ishigami, Yuuki Arai, Akiko Hikoya, Yasuhiko Hirami, Masafumi Ohtsubo, Shinji Ueno, Hiroko Terasaki, Miho Sato, Hiroshi Nakanishi, Shiori Endo, Kunihiro Mizuta, Hiroyuki Mineta, Mineo Kondo, Masayo Takahashi, Shinsei Minoshima, and Yoshihiro Hotta
Organizer
XVIth International Symposium on Retinal Degeneration
Place of Presentation
California
Year and Date
2014-07-13 – 2014-07-18
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