2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462665
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
平岡 美紀 札幌医科大学, 医学部, 講師 (80246983)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大黒 浩 札幌医科大学, 医学部, 教授 (30203748)
吉田 香織 札幌医科大学, 医学部, 助教 (40596160)
阿部 晃 札幌医科大学, 医学部, 講師 (70136927)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 眼内炎症 / エンドトキシン / ルイスラット / リソゾーム / ホスホリパーゼA2 / ぶどう膜炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、眼内の浄化機構を明らかにする目的で、特にリソゾーム由来のリン脂質分解酵素の動態を軸に眼内の脂質代謝を解明し、さらに眼疾患での脂質分解の差異と病態への関与を明らかにするものである。
まず、平成２６年度の研究実施計画では、動物モデルを用いて眼内炎症における房水中のリソゾームホスホリパーゼA2（LPLA2）のリン脂質代謝への関与を調べることであった。
そこで、ルイスラットにエンドトキシン誘発ぶどう膜炎（E I U）を起こし、その際の眼内タンパク量・LPLA2活性の経時的な変化と炎症との相関を検討した。その結果、ルイスラットのEIUモデルでは、ぶどう膜炎惹起前に比べ、惹起後12 時間には房水中のタンパク量が増加しており、惹起後24 時間で房水中のタンパク量が最大になり、惹起後48 時間ではほぼ惹起前の量に戻る。このことは、既報のように惹起後24 時間をピークとした眼内炎症が起こったことが確認できた。また、惹起前・惹起後12、24、48時間の房水および血清を採取し、LPLA2活性を比較した結果、房水中のLPLA2活性は眼内炎症と呼応して増減がみられたが、血清のLPLA2活性はエンドトキシン投与の影響を受けなかった。このことは、眼内炎症に伴って房水中のLPLA2活性が上昇したことが明らかになった。また、同じモデルを用いて眼球の免疫組織学的検討を行ったところ、EIU惹起前にはLPLA2タンパクの発現はみられなかったが、惹起後２４時間の炎症極期の眼球では前房内に浸潤した細胞にLPLA2タンパクの発現がみられた。CD11bやCD68との共染色から、LPLA2を発現している細胞は好中球であることが明らかになった。この結果から、眼内炎症において前房内に浸潤した好中球によって房水中のLPLA2活性が増強し、眼内炎症によって増えた房水中の細胞断片などが線維柱帯で濾過され、線維柱帯の貪食細胞で消化・分解される際に細胞断片の成分であるリン脂質の分解にLPLA2が作用していることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の事前に、動物モデルの系を確立しており、またリソゾームホスホリパーゼA2についてもその化学特性を明らかにしており、活性測定法も確立していた。そのため、当初の計画を滞りなく行えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
２7年度以降の計画としては、まず眼内炎症に伴って活発化する房水浄化機構におけるLPLA2の役割を明らかにする目的で、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎（EIU）モデルを用いて、前房内のLPLA2 活性を阻害した時の、炎症の遷延化と線維柱帯でのリン脂質消化への影響を生化学的、組織学的に検討する。
そのためにLPLA2欠損マウスをもちいてEIUを起こした時のぶどう膜炎惹起前、惹起後炎症初期（12 時間後）、惹起後炎症極期（24 時間後）、消炎後期（48 時間後）について、各群それぞれ房水を収集し、脂質の量と成分の解析、さらに眼球摘出した検体の組織学的検討を行う。とくに炎症の程度と脂質の貯留について、リン脂質染色、また貪食細胞のマーカーとLPLA2 の抗体を用いて二重染色を行い、その分布を比較する。一方、生化学的検討として、それぞれの眼組織の部位別にリン脂質の量を定量する。これにより、炎症および消炎期でのリン脂質代謝におけるLPLA2 の役割を解明することができる。
さらに房水浄化機構におけるLPLA2の関与を明らかとする目的で、線維柱帯での異物貪食時のリン脂質代謝とLPLA2の関わりを調べる。そのために線維柱帯の培養細胞系を用いて、まず異物としてLatexビーズやZymosan を添加した時の貪食経過と線維柱帯細胞および培養上清中のLPLA2 活性を経時的に解析する。さらに発現ベクターを用いて過剰にLPLA2 を発現させて精製した合成LPLA2 を作成し、それを線維柱帯細胞に添加させて異物 を貪食させた時の貪食能とリン脂質分解作用への影響を解析する。これにより、房水浄化機構でのリン脂質代謝におけるLPLA2 の役割を解明することができる。
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