2015 Fiscal Year Research-status Report
ラマン分光法を用いた生体内ミトコンドリア機能の評価法の開発と視神経疾患の病態解明
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26462684
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
森本 壮 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00530198)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ラマン分光法 / ミトコンドリア病 / 網膜神経節細胞 / cytochrome c / レーベル病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題１のグルタミン酸負荷によるRGC5細胞の細胞死に至る各段階でのcyt cのラマン画像の生物学的意味を解明については、今年度は、ラマンcyt cのシグナル低下が実際の細胞内cyt cタンパク濃度とどのように関連するか、cyt cのタンパク濃度をELISA法を用いて測定し、グルタミン酸投与により、細胞内cyt cのタンパク濃度の減少が投与時間と統計学的に有意な負の相関を示したがラマンcyt cシグナル強度とcyt cのタンパク濃度と有意な相関を示さなかった。またミトコンドリア機能を評価するため細胞内ATP濃度についてもELISA法で測定し、グルタミン酸投与により細胞内ATP濃度が減少し、投与時間と統計学的に有意な負の相関を示した。また、ATPの減少は、ラマンcyt cシグナル強度と有意な負の相関を示した。
このようにラマンcytcシグナルの低下とcytｃタンパク濃度の低下が解離するため、細胞内のcyt cを蛍光色素で標識し、GFPでcytcを標識したRGC5細胞を樹立したが、GFP-RGC5細胞は、GFPの蛍光波長がcyt cラマンシグナルと干渉するため、Teal Fluorescent Protein (TFP)で標識するRGC5細胞の樹立に着手した。
課題４のRGC5細胞由来のLeber病サイブリッド細胞の作製とラマン分光法を用いた解析についても、ミトコンドリア病であるLeber病疾患モデルとしてミトコンドリアの電子伝達系complex1の機能を阻害するrotenoneを投与によるLeber病モデルのRGC5細胞を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、課題１のグルタミン酸負荷によるRGC5細胞の細胞死に至る各段階でのcyt cのラマン画像の生物学的意味を解明で、ラマンcyt cのシグナル低下が実際の細胞内cyt cタンパク濃度とどのように関連するか、cyt cのタンパク濃度をELISA法を用いて測定し、グルタミン酸投与前のRGC5の細胞内cyt cのタンパクの平均濃度14.5±1.59ug/ulが投与120分後には8.47±4.20ug/ulと投与時間と統計学的に有意な負の相関を示した（P ＝0.0012）。しかしながら、ラマンcyt cシグナル強度と有意な相関を示さなかった。
また、ラマンcyt cのシグナルがミトコンドリアの分布と似ていることから、細胞死の各段階でのミトコンドリア機能を評価するため細胞内ATP濃度についてもELISA法で測定し、グルタミン酸投与前のRGC5の細胞内ATP平均濃度は6.39±2.26uMが投与120分後0.30±0.08uMと急激に減少し、投与時間と統計学的に有意な負の相関を示した（P ＜ 0.0001）。また、ATPの減少は、ラマンcyt cシグナル強度と有意な負の相関を示した（P = 0.007）。
また、ラマンcytcシグナルの低下とcytｃタンパク濃度の低下の解離について検討するため細胞内のcyt cを蛍光色素で標識し、ラマン顕微鏡で蛍光色素のシグナルとcyt cのラマンシグナルの分布の変化について調べる研究を進めた。Green Fluorescent Protein (GFP) でcytcを標識したRGC5細胞を樹立したが、GFP-RGC5細胞は、GFPの蛍光波長がcyt cラマンシグナルと干渉するため、別の蛍光色素であるTeal Fluorescent Protein (TFP)で標識するRGC5細胞の樹立に着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題１．グルタミン酸負荷によるRGC5細胞の細胞死に至る各段階でのcyt cのラマン画像の生物学的意味を解明する。については、Teal Fluorescent Protein (TFP)で標識するRGC5細胞を樹立し、TFP-RGC5細胞でグルタミン酸による細胞死を誘導し、cyt cの細胞内分布とラマンcyt cシグナルの低下との関連について検討する。
課題４．RGC5細胞由来のLeber病サイブリッド細胞の作製とラマン分光法を用いた解析。ミトコンドリアの電子伝達系complex1の機能を阻害するrotenoneを投与したLeber病モデルのRGC5細胞としてラマン顕微鏡で撮影し、ミトコンドリア病でのラマンcyt cシグナルの変化について検討する。ミトコンドリア病であるLeber病疾患モデルとしてサイブリッド細胞の作製にも着手する。最終目標はLeber病患者の血小板（mtDNAあり）とRGC5ローゼロ細胞（mtDNAなし）からLeber病のサイブリッド細胞（患者由来のmtDNAを含む）を作製して、ラマン顕微鏡で計測することであるが、その前段階としてラットの血小板とRGC5ローゼロ細胞のサイブリッド細胞の作製、正常人血小板とRGC5ローゼロ細胞のサイブリッド細胞を作製する。
課題１と４を主に進めるが、課題２．細胞死に至る過程でのラマンシフト波形の全体的な変化を解析し、ラマンシフト全体での生物学的意味を解明する。
と課題３．ラマン分光法を用いたミトコンドリア機能の評価法の確立と臨
床応用。についても着手していく。課題２については、課題１、３のデータを用いることができるため、並行してすすめることができると考える。課題３については、Leber遺伝性視神経症の患者から採取した白血球（mtDNAの異常を有する）に対してラマン分光法による解析を行うのが最終目標であるが、その前段階の研究として、まずはラットから採取した白血球を用いて白血球を測定できる条件を見出しす。 可能であれば健康人の白血球の測定まで行う。
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| Causes of Carryover |
研究に使用する試薬や物品が為替の影響で予想より安くなったため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に実験に必要な試薬や細胞の購入費に当てる予定である。
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