2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462690
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
大橋 裕一 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00116005)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 康人 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (70314953)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ケラトサイト / バイオイメージング / 骨髄細胞 / 再生医療 / Fucci |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Keratocan-IRES2-nls-CreノックインマウスF1雄とROSA26mT/mGによる交配により得られた、Keratocan-IRES2-nls-Cre /ROSA26mT/mGはケラトサイトにおいてCreの発現が確認され、ケラトサイト特異的なバイオイメージングが可能であることが示された。Keratocan-IRES2-nls-Cre /ROSA26mT/mG においては、ケラトサイトの細胞質の形態が従来、信じられていたものとはかなり異なることや、上皮欠損作製後にはケラトサイトが崩壊すること。さらに、上皮欠損作製後の角膜実質深層においては、ケラトサイトの前駆細胞と考えられる丸い突起を周囲に多数出した、類円形の間葉系細胞が分裂して移動し、ケラトサイト様に形状を変化させていく様子が経時的に観察できている。この細胞の分裂を詳細に検討するために、細胞周期のバイオイメージングを可能にするsingle allele組織特異的Fucci2（G1）（S/G2/M）マウス作製のための、C57BL/6N 由来ES細胞の相同組換えスクリーニングにより、ROSA26にCAG-loxP-pgkNeo-loxP mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)の挿入に成功した。相同組換えスクリーニング陽性37クローンのうち、１０クローンでサザンブロットでも相同組換えを確認し、そのうちの３つのクローン（#15、＃28、＃38）で8細胞期へのES細胞注入を行った。得られたキメラマウスで３クローンともgermline transmissionを確認しており、現在6匹のF1マウスを得ているが、機能解析にはまだ時間が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ROSA26(CAG-loxP-pgkNeo-loxP-mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)の作製は、予定より早期に実現した。機能解析には時間を要するが、概ね順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ROSA26(CAG-loxP-pgkNeo-loxP-mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)とKeratocan-IRES2-nls-Creの交配により、Keratocan-IRES2-nls-Cre/ ROSA26(CAG-loxP-pgkNeo-loxP-mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)を作製し、ケラトサイト消失時の周辺部角膜実質細胞の細胞分裂の状態を経時観察する。Keratocan-IRES2-nls-Cre /ROSA26mT/mG骨髄由来線維芽細胞を角膜実質内に移植し、ケラトカン発現細胞の有無と形態を確認する。
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| Causes of Carryover |
ROSA26(CAG-loxP-pgkNeo-loxP-mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)の作製の費用の支払いを次年度に繰り越したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ROSA26(CAG-loxP-pgkNeo-loxP-mVenus-hGeminin(1-110)-IRES2-mcherry-hCdt1(30-120)の作製の費用のうちの1部負担金を支払う。
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