2015 Fiscal Year Research-status Report
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26462697
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
渡邊 交世 杏林大学, 医学部, 講師 (90458901)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ぶどう膜炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、18-25塩基からなるmicroRNA (miRNA)が標的mRNAの発現を制御することで発生・分化などの様々な生命現象を制御することが報告されている。我々はぶどう膜炎の病態におけるmiRNAの作用について検討するためヒト難治性ぶどう膜炎の動物モデルである実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎 (EAU)を用いてEAUの発症初期、炎症極期、消退期におけるmiRNAの発現について検討を行った。その結果、炎症極期ではmiRNA-223、miRNA-142-5p、miRNA-146aなどのmiRNAの発現上昇がみられた。一方で、miRNA-181a、183、124、331の４つのmiRNAの発現が免疫後14日目で低下していることを確認した。さらに定量PCRにて発現変動を確認したところ、miRNA-223、146aは免疫後14日目に発現のピークを示し、21日目には低下した。miRNA-181aは免疫後7、14、21日目において免疫前に比較して発現の低下がみられた。平成27年度は上記の発現変動のみられたmiRNAの中で発現上昇のみられたmiRNA-223、および146a、発現低下のみられたmiR-181aの網膜内における局在についてIn situ hybridization (ISH)法を用いて検討した。その結果、無処置ラットの網膜では内顆粒層を中心にmiRNA-223、および146aの発現が観察され、さらにEAUの炎症極期である免疫後14日目の網膜では内顆粒層に加えて眼内に浸潤した炎症細胞を主体にmiRNA-223、および146aの発現がみられた。一方、miRNA-181は無処置ラットの網膜、およびで免疫後14日目の網膜の内顆粒層には発現が確認された (Br J Ophthalmol、2016;100:425-31)。以上の結果からmiRNAがEAUの病態に関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を用いて1) miRNA-146の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、およびmiRNA-146の局在について免疫組織染色にて検討、2) miRNA-181の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、およびmiRNA-181の局在の検討、 3) エンドトキシン誘導実験的ぶどう膜炎(EIU)における虹彩組織中のmiRNAの網羅的発現解析の3点の実験を予定した。
1)、2)についてISH法にてmiRNA-146a、223、181の発現を確認したところ、無処置ラットの網膜では内顆粒層を中心にmiRNA―146aの発現が観察され、さらにEAUの炎症極期である免疫後14日目の網膜では内顆粒層に加えて眼内に浸潤した炎症細胞を主体にmiRNA-223、および146aの発現がみられた。一方、miRNA-181は無処置ラットの網膜、およびで免疫後14日目の網膜の内顆粒層には発現が確認された。さらに免疫後14日目で前房水を採取しIL-1、MCP-1 の発現をELISA法にて測定したところ免疫直前に比較して有意に上昇していた (Br J Ophthalmol、2016;100:425-31)。miRNA-146aおよびmiRNA-181aの硝子体注入によるEAUの抑制効果を評価する実験は上記ISHの実験に時間を要したため実施に至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の実験計画では1) miRNA-146 の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、2) エンドトキシン誘導実験的ぶどう膜炎(EIU)における虹彩組織中のmiRNAの発現解析、機能解析を予定している。
1)これまでの報告では単球やマクロファージに発現しているToll like receptor 4 (TLR4)からの刺激によって誘導されたmiRNA-146がNF-kBの細胞内シグナルを抑制することで炎症反応を制御することが知られている。そこで免疫直前および免疫後7日目にアテロコラーゲンと混合したmiRNA-146を硝子体内投与、細隙灯顕微鏡にて臨床スコアを評価する。また炎症抑制効果を確認後は眼球を摘出し、網膜におけるIL-1、IL-6、TNF-a、MCP-1の発現をELISA法、定量PCR法にて解析する。
2)ではEAUと同様に難治性ぶどう膜炎の動物モデルとして知られているエンドトキシン誘導実験的ぶどう膜炎(EIU)を用いて眼局所におけるmiRNAの発現を経時的に評価する。発現の上昇、低下が確認されたmiRNAはISH法を用いてその局在を検討する。EIUの誘導にはリポポリサッカロイドを用いるがLPS投与後、12時間後にmiRNA-124がLPS投与前に比較して約1/3程度まで低下していることを確認している。EIUの病態の進行にはマクロファージやマイクログリアが関与していることが知られていることから、in vitroにてマクロファージをLPSにて刺激培養し、miRNA-124をtransfectionすることでマクロファージからの炎症性サイトカインやケモカインの産生が抑制されるのか検討を行う。
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| Causes of Carryover |
平成27年度の実験計画では、EAUを用いて1) miRNA-146の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、およびmiRNA-146の局在について免疫組織染色にて検討、2) miRNA-181の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、およびmiRNA-181の局在の検討、眼局所における炎症性サイトカイン、ケモカインの発現について定量PCR、ELISA法を用いた検討の２点を予定した。1)および2)の局在の同定に時間を要したため、miRNAの眼内投与によるEAUの抑制効果を評価する実験を実施するに至らなかった。そのため当初予定していた使用額に至らず、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の実験計画では1) miRNA-146の硝子体内投与によるEAUの抑制効果の検討、2)エンドトキシン誘導実験的ぶどう膜炎(EIU)における虹彩組織中のmiRNAの経時な発現解析、機能解析を行う予定である。
1)ではmiRNA-146硝子体内投与後の炎症抑制効果を細隙灯顕微鏡所見、病理組織所見からスコアリングを行う。また眼球を摘出し、網膜におけるIL-1、IL-6、TNF-a、MCP-1の発現をELISA法、定量PCR法にて検討する。2)ではmiRNAの発現についてmiRNA CARD、定量PCRによる発現解析を行う。またISH法にて各miRNAの局在を確認する。機能解析は培養マクロファージを用いる。上記実験計画施行のため動物(ラット)の購入、各種試薬、ELISAキットなどを購入予定である。
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[Journal Article] Dehydroxymethylepoxyquinomicin, a novel nuclear factor-κB inhibitor, reduces chemokines and adhesion molecule expression induced by IL-1β in human corneal fibroblasts.2015
Author(s)
Inokawa S, Watanabe T, Keino H, Sato Y, Hirakata A, Okada AA, Fukuda K, Fukushima A, Umezawa K.
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Journal Title
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.
Volume: 253
Pages: 557-563.
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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