コラーゲン結合型VEGF-Cによる効果的なリンパ管新生の研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462731
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 松本 洋 岡山大学, 大学病院, 助教 (20423329)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松下 治 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00209537) ; 杉山 成史 岡山大学, 大学病院, その他 (80379776) ; 美間 健彦 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80596437)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: リンパ管再生 / VEGF-C / 融合蛋白

Outline of Annual Research Achievements

VEGF-C-コラーゲン結合ドメイン(CBD)融合タンパク質の生産系を確立した。当初、Brevibacillus分泌発現システムを用いて生産を行っていたが、精製後も挟雑蛋白が多かった。そのため、培養条件の検討やイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー等を試みたが、挟雑蛋白の除去には至らなかった。そのため、昆虫細胞（Sf-9）を用いた生産系へ変更した。昆虫細胞用のウイルスベクターを作成し直し、昆虫細胞に導入し融合蛋白を生産・精製した。挟雑蛋白は依然として認めるものの、絶対量は減少した。
次に、融合蛋白質のコラーゲン結合能を検査し、不溶性コラーゲンに対する結合能を確認した。さらに、培養リンパ管内皮細胞における融合蛋白の活性を調査した。通常の培養ではリンパ管内皮細胞に対するVEGF-C自体の増殖活性が評価出来なかった。そこで様々な条件検討をした結果、フィブロネクチンコーティング上で培養したところ、MTSアッセイにて何とか増殖活性が評価出来つつある。しかし、結果はまだ安定しておらず、さらなる検討を行っているところである。また、VEGF-Cがリンパ管内皮細胞増殖を活性化する細胞内MAPKシグナル伝達についても調査し、VEGF-C自体の活性は評価出来たが、融合蛋白の活性は調査中である。遊走活性やチューブ形成能に関しても調査を行っているが、VEGF-C自体の活性評価が今のところ出来ていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

培養細胞におけるVEGF-C自体の活性評価法が確立出来ていないため、融合蛋白の活性評価に苦慮している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、安定したVEGF-C活性評価法を確立するため、さらなる条件検討等を進めていく。また、同時に実験動物における活性評価も進めていく予定である。

Causes of Carryover

予定よりも安く物品購入が出来たため、未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

培地、実験動物、コラーゲン基剤、免疫染色用試薬等の購入に使用する予定である。