Development of collagen binding VEGF-C for lymphangiogenesis

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26462731
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 松本 洋 岡山大学, 大学病院, 医員 (20423329)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松下 治 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (00209537) ; 杉山 成史 岡山大学, 大学病院, 助教 (80379776) ; 美間 健彦 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (80596437)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: リンパ管再生 / VEGF-C / 融合タンパク

Outline of Annual Research Achievements

まず昆虫細胞（Sf9）を用いたタンパク生産系において、きちんと分泌経路を辿ることで生理活性を有するVEGF-Cが生産出来ることを確認した。N末端に分泌シグナルの１種であるMelittinを付加し、C末端に回収用のHisタグを付加したVEGF-CのDNA配列を設計し、２本鎖DNA作成した。このDNAをTAクローニングし、シークエンサーで配列を確認した。これを元にSf9でタンパクを生産した。TAクローニングしたDNA配列を、昆虫細胞へ導入するためのpFastBacに載せ換えて、DH5αに導入した。導入したDH5αよりpFastBacを回収し、DH10Bacに導入し、DH10Bac内で目的の配列をBacmidに導入した。このDH10BacよりBacmidを抽出し、Sf9に感染させ目的の配列を持つバキュロウイルスを作成した。このウイルスを繰り返し感染させることによりウイルス濃度を上げ、最終的には培養上清から目的のVEGF-Cタンパクを回収した。このVEGF-Cを用いてErkリン酸化解析を行い、生理活性を有することを確認した。次に、新たなプライマーを設計し、このMelittinを付加したVEGF-CのDNAと以前使っていたPKD-CBDのDNAとをPCRで合成し、N末端にMelittinがC末端にHisタグが付いており、それぞれVEGF-Cの前と後にPKD-CBDが付加されたDNAを作成した。PCRで合成したDNAをTAクローニングし、シークエンサーで配列を確認した。前回同様にTAクローニングしたDNA配列を、昆虫細胞へ導入するためのpFastBacに載せ換えて、DH5αに導入した。しかし、導入したDH5αはコロニー形成不良で、形成したコロニーを培養しても増えなかった。DH5αからのDNAの回収効率の問題を考え、抽出過程などの条件を検討したが、残念ながらコロニーは得られなかった。