2014 Fiscal Year Research-status Report
AutophagyによるARDS制御機構解明とmicroRNAによる治療法開発
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26462757
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
田代 貴大 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (00613340)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 順弘 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 教授 (30195341)
蒲原 英伸 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 准教授 (90398222)
鷺島 克之 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (40336235)
廣佐古 進 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 助教 (70432995)
新森 大佑 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (70635789)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ARDS / Autophagy / microRNA / Exosome |
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| Outline of Annual Research Achievements |
過度の侵襲によって誘導された高サイトカイン血症により全身性の炎症反応(SIRS)が惹起される。この間、肺組織では肺胞上皮細胞や血管内皮細胞が障害され血管透過性が亢進による。その結果、肺水腫による低酸素を主徴候としたARDSを併発する。この病態の解明のため、 ARDS患者から血清･痰・白血球を採取することに留意してきた。特に血清中に分泌されるexosomeにはmicroRNAなどの遺伝子が存在することを我々は確認してきた(bioanalizerなど)。ARDSに特異的なmicroRNAを同定するために、まず血清からのexosomal mcroRNAの網羅的解析を行った。ARDSの病態には急性期の高度な炎症を伴う時期と晩期の中程度の炎症が遷延し、肺組織の線維化に関与する時期が存在するが、これらに特異的なmicroRNAを幾つか同定してきた。今後はSIRSなどの炎症疾患との相違点や臨床上の転帰に寄与する遺伝子などの同定を臨床学的指標と共に比較検証していく予定である。さらに、Autophagyの制御に関わる遺伝子(miR30, 376b, 204, 183,376b,101,31,34,9,
221/222など)とARDSとの関連性を検討し、診断・治療に関与する新規遺伝子を探索していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ARDS患者血清のサンプルの収集を軸に行ってきた。可能な範囲で気管支液からのexosomeの分離とmicroRNAの分離を試案してきたが、まだ十分ではなく、BALでの採取なども検討中である。血清を用いてexosomeを分離し、次にmicroRNAの精製を行ってきた。ARDS発症の急性期と炎症遷延する晩期の関わるmicroRNAを同定するために、臨床経過と合致するサンプルを用いて網羅的解析を行った。まだ、解析の途中であるが、幾つかにexosomal microRNAを同定することができた。検証実験として、時系列のサンプルを回収しているので、経時的な発現解析をARDS患者に絞って解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
網羅的解析から同定された遺伝子群を検証するために、SIRSなどの全身炎症疾患との相違点や臨床上のARDSの転帰に寄与する遺伝子などの同定を臨床学的指標と共に比較検証していく予定である。さらに、Autophagyの制御には複数の分子が関与しているが、それらの発現を制御する遺伝子として、miR30, 376b, 204, 183,376b,101,31,34,9,221/222などが報告されている。Autophagy関連遺伝子とARDSとの関連性を検討し、診断・治療に関与する新規遺伝子を明らかにしていく予定である。
また、In-vitroにおいて、肺胞上皮細胞株(A549など)、白血球系細胞株(THP-1,HL-60など)、線維芽細胞株(MRC-9など)を用いて、標的遺伝子をtransient transfectionもしくはLentivirus(Tet ON/OFF)を用いたconstitutive発現モデルを作製し、標的遺伝子のgain of functionもしくはloss of functionを有した細胞を構築し、Autophagyを主体とした機能解析を行っていければと考えている。
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| Causes of Carryover |
ARDSの重症度分類はPF ratioと呼吸器の状況に準じて分類されている(Berlin definition)が、現状はARDSの発症機序(肺炎などの1次性ARDS、肺外からの敗血症などの2次性ARDS) により死亡率に大きく寄与する可能性が高い。集積しているARDS患者サンプルを用いて臨床的に検討中であり、比較対象となる検体の抽出に時間を要している。引き続き集積と解析を進めていきAutophagyとの関連性を明らかにするために研究費が必要である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
検体からのmicroRNAの分離と解析の結果が研究の基盤となるため、microRNAの分離のためのキットと解析に必要な消耗品が研究費の主なものとなる。ARDSとAutophagyとの関連性を明らかにするための網羅的解析にはcDNA arrayやmicroRNA arrayなどによる解析も予定している。標的となるmicroRNAが同定された後はAutophagyとの関連性をin-vitroの系を用いて証明していきたい。さらに、国内外の学会等に参加し、Autophagy, ARDS, microRNAに関する研究に着眼し情報を収集していく。以上のような計画を遂行していくために研究費を使用していく予定である。報を収集していく。以上のような計画を遂行していくために研究費を使用していく予定である。
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