2014 Fiscal Year Research-status Report
エナメル芽細胞分化を制御する微小環境変化と星状網血管との関係
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26462794
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
大津 圭史 岩手医科大学, 歯学部, 助教 (60509066)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 尚樹 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (20190100)
熊上 深香(坂野深香) 岩手医科大学, 歯学部, 研究員 (30710826)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 歯 / エナメル芽細胞 / 低酸素 / HIF1 / Rhoシグナリング / 血管新生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯胚発生の初期では上皮組織であるエナメル器には血管が存在しない。しかし、エナメル芽細胞が基質分泌を開始する時期になると周囲組織から星状網へ血管が侵入して、エナメル芽細胞と密接な位置関係をとるようになる。しかしこの上皮への血管の侵入が、どのような生理的役割を持っているのかは明確でない。われわれはRho シグナルが、エナメル芽細胞分化を制御していることを見いだした。そこで本研究では、星状網への血管侵入によって引き起こされる組織内酸素濃度変化がRho シグナリングを介してエナメル芽細胞分化を制御すると考え、これを検証するための研究を計画した。
まず始めに、胎生12日から18日目の歯胚における低酸素部位の局在を組織低酸素部位検出試薬の投与により検討した。その結果として投与する試薬の濃度、投与時間、免疫染色の条件などの最適化がなされ、歯胚発生期における低酸素領域の局在変化が明らかとなったた。
次にFLK1-GFPマウスとK14Cre-tdTomatoマウスをかけ合わせることで、血管内皮細胞と歯胚上皮細胞を同時に観察できるマウスの作製を試みた。その結果、新生血管内皮細胞は緑、歯胚細胞が赤の蛍光で識別されるマウスの作製に成功した。現在、このマウス歯胚を用いたスライスカルチャーリアルタイムイメージング技術の構築を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度、第1の目的を歯胚発生過程における新生血管と組織内酸素濃度との関係を明らかにすることとし、歯胚発生中の低酸素部位を組織学的に解析することを試みた。この実験の実験手技、実験条件の最適化を行い、そこから再現性の高いクリアなデータが得られた。
第二の目的として、新生血管とエナメル上皮細胞の経時的局在変化を捉えるためにFLK1-GFPマウスとK14Cre-tdTOMATOの掛け合わせによるマウスの作製を行った。胎仔の数が少なく、実験が予定どおりのスピードで進まなかったが、新生血管内皮細胞は緑、歯胚細胞が赤の蛍光を発するマウスのフェノタイプが得られた。
第三の目的としてE14からE18のマウス第一大臼歯歯胚の星状網、内エナメル上皮、外エナメル上皮、歯小嚢、などをマイクロダイジェスチョンによって切り出してmRNAを採取し，PCRアレイを用いて、血管新生、EMT、Rhoシグナル関連遺伝子群の発現変化を網羅的に解析することを予定した。しかし、マイクロダイセクションの実験手技の確立に時間がかかり、当該年度に予定した結果を十分得ることができなかった。
以上より、本研究計画はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度において確立させた実験系に対しては、さらに実験を重ね、データの信頼性を確認する。
FLK1-GFP;K14Cre-tdTomatoマウスに関しては今後、十分実験に使用できるだけのマウスの数を確保し、リアルタイムイメージングの実験を行っていく予定である。
マイクロダイセクションの実験手技がいまだ確立されていないので、繰り返し検討を行い、早期の確立を目指す。
来年度はHIF1aノックアウトマウスの解析を予定しているので、当該マウスの購入をすすめ、動物の維持、解析を行う。
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| Causes of Carryover |
レーザマイクロダイセクションを用いた実験が予定通りに進まなかったこと、スライスカルチャーの実験実施回数が当初予定した数より少なかったことから、それに関する実験試薬、備品の購入が予定した額よりも少なくなってしまった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
翌年度は、トランスジェニックマウスの新規購入と、当該年度に実施できなかった実験を更に行うことで、適正に予算の執行が行えると考える。
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