2014 Fiscal Year Research-status Report
マウス顎顔面発生におけるリンパ管新生と分子機構の解明
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26462799
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (70350139)
島津 徳人 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (10297947)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 歯学 / 病理学 / マウス胎仔 / 顎顔面発生 / リンパ管新生 / リンパ管内皮細胞 / 細胞分化制御 / 遺伝子発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類のリンパ管初期発生においては、体幹部前主静脈がリンパ管内皮細胞分化の起点になることが知られているが、顎顔面諸器官の形態形成にともなうリンパ管発生の詳細については不明である。本研究では、マウス顎顔面領域における時空間的なリンパ管発生を3次元形態観察により可視化するとともに、静脈内皮細胞からリンパ管内皮前駆細胞への分化と出芽、それに継続するリンパ管内皮細胞の遊走・集簇・管腔形成に至る細胞表現型の特徴と分子制御機構について明らかにする。
初年度では、マウス胎仔（E9.5～14.5）の下顎突起正中部・舌組織におけるリンパ管発生に関わる遺伝子発現プロファイルを遺伝子発現解析により作成した。その結果、リンパ管発生誘導に働く遺伝子発現はE9.5から検出されたが、CoupTF2とProx1はE11.5以降に発現上昇し、Lyve1はE14.5で高発現を示した。次いで、顎顔面領域において、静脈内皮からのリンパ管内皮細胞の分化、出芽・遊走、集簇・リンパ嚢の形成・リンパ管腔形成の一連の過程におけるリンパ管内皮細胞の表現型を追跡することを目的として、リンパ管内皮マーカ（Lyve1）と分化誘導因子（Prox1）の特異抗体による多重免疫染色によりリンパ管発生を形態学的に検討した。その結果、E9.5～11.5においてリンパ管発生は観察されず、E12.5からProx1 (+) / Lyve1 (+) 細胞が出現し、E14.5前後では舌基部の静脈内皮細胞においてリンパ管内皮への分化傾向と出芽・遊走・管腔形成を認めた。以上の結果から、舌リンパ管の発生は主静脈から遊走したリンパ管内皮細胞とは別個に、舌組織独自にリンパ管内皮細胞の分化とリンパ管形成を遂げることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度においては、まず、マウス胎仔（E9.5～14.5）の顎顔面領域でのリンパ管発生に関わる遺伝子発現について検討した。下顎突起での遺伝子発現解析（マイクロアレイ解析（GeneChipアレイ、Mouse Expression 430 2.0 Array、Affymetrix、USA）とIngenuity Pathway Analysis（IPA）解析（Ingenuity Systems、USA））を実施し、GeneSpring Version 7.3.1（Silicon Genetics Inc.、USA）を用いてリンパ管新生に関連する遺伝子リストを作成した。今回の遺伝子発現解析に際して、遺伝子データベースと文献情報を参照して、リンパ管発生誘導に働く遺伝子（リンパ管内皮細胞に特異的発現・リンパ管内皮の分化制御因子を含む）プロファイルを作成し、遺伝子発現レベルの推移を検証できた。次に、リンパ管内皮マーカ（Lyve1）と分化誘導因子（Prox1）の特異抗体を用いた多重免疫染色により、顎顔面領域における静脈からのリンパ管内皮細胞の伸展過程を可視化することができた。この手法を駆使することによって、静脈内皮からのリンパ管内皮細胞の分化、出芽・遊走、集簇・リンパ嚢の形成・リンパ管腔形成の一連の過程が、顎顔面領域（今回の観察では舌組織に着目）においても生じることが確かめられた。胎生期舌組織では、主静脈から遊走したリンパ管内皮細胞からのリンパ管形成とは別個に、舌組織内の静脈を構成する内皮細胞からリンパ管内皮細胞が分化し、リンパ管を形成することが組織切片上で明瞭に観察することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降、初年度に継続してPecam1・Lyve1・Prox1・CoupTF2抗体を組み合わせた多重免疫標識に基づく組織観察と形態解析を行い、解析結果の再現性を確認するとともに、リンパ管内皮細胞の出芽・遊走に関与する周囲環境からのシグナルを調べる目的では、Vegfr3、Vegfc、Vegfd、Cxcl12、Cxcr4、Rac1などの抗体を用いた多重蛍光免疫染色を施し、共焦点顕微鏡により組織観察と形態解析を行う。顎顔面領域でのリンパ管内皮細胞の伸展過程を可視化することにより、組織器官形成にともなうリンパ管網の形成の推移を捉える。なお、Lyve1陽性を示すマクロファージ系細胞を識別するためには、マクロファージを標識するMac1とLyve1抗体との二重免疫染色を施す（田谷分担）。Pecam1/Lyve1二重免疫染色（田谷分担）を施した頭部領域のパラフィン連続切片から組織立体構築し（島津分担）、顎顔面領域内のすべてのLyve1陽性のリンパ管内皮細胞を3次元空間にマッピングする。顕微切断（Laser microdissection・LMD）法で分離・採取した組織試料（遊走細胞を含む組織領域、および対照試料として同時期のリンパ管発生がみられない結合織）を対象として、リンパ管内皮細胞の移動経路を制御する新規の作用因子を抽出するためにDNAマイクロアレイとIPA解析を行う（佐藤代表・添野分担）。これらの解析で顎顔面領域でのリンパ管発生に寄与する遺伝子候補を抽出し、顕微切断法により分離・採取した試料を用いて、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の定量解析を行う（佐藤代表・添野分担）。抽出された遺伝子候補を対象として、モルフォリノAS-ODN・阻害剤・中和抗体の投与、標的分子を浸漬したビーズ添付によるノックダウンを計画する（田谷・添野分担）。
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| Causes of Carryover |
平成26年度では、研究分担者の作業配分を効率的に行うことによって、研究の伸展状況から実験補助予定であった大学院生への謝金が不必要になったことにより、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後の研究の推進方策として、①DNAマイクロアレイとIPA解析により候補に挙がった顎顔面領域でのリンパ管発生に寄与する遺伝子について、顕微切断法により分離・採取した試料を用いて、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の定量解析を行うことと、②リンパ管内皮細胞の出芽・遊走に関与する周囲環境からのシグナルを調べる目的では、Vegfr3、Vegfc、Vegfd、Cxcl12、Cxcr4、Rac1などの抗体を用いた多重蛍光免疫染色を施し、共焦点顕微鏡により組織観察と形態解析を行うことを計画している。次年度使用額は、これらの計画を推進するにあたって、より多くのqPCR用のプライマーと免疫染色用の抗体の購入にあてることによって、より幅広い候補分子の発現と局在を解析することが可能となり、より信頼のおけるデータを得ることができるものと考えている。
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