2015 Fiscal Year Research-status Report
唾液腺における開口分泌とCa2+、cAMP及びSNARE動態のリアルタイム解析
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26462820
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 唾液分泌 / アミラーゼ分泌 / Ca2+シグナル / ウイルスベクター / Ca2+センサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、唾液腺細胞における開口分泌と、Ca2+ならびにcAMPシグナル、SNAREタンパクの関わりを明らかにし、唾液腺における開口分泌の分子基盤を解明する事を目指す。
１）ムスカリン受容体アゴニストであるピロカルピンを前投与すると、非前投与群のコントロールと比較して、唾液分泌量が増加した。さらに唾液中のアミラーゼ量を測定すると、ピロカルピン前投与により唾液分泌量に比例してアミラーゼ量も増加していた。このことから、ムスカリン受容体刺激により水分泌とともにアミラーゼ分泌が起こることが示された。このアミラーゼ分泌はCa2+依存性リン酸化酵素(PKC)の活性化を介している可能性が考えられる。
アセチルコリンの持続的静脈内投与による顎下腺からの唾液分泌を、顎下腺開口部に挿入した微小圧力センサーによりリアルタイムで測定した。ピロカルピン前投与群では、低濃度のアセチルコリン刺激による唾液分泌の亢進が観察された。この結果は、ピロカルピン前投与により唾液腺腺房細胞の感受性が亢進した結果と考えられる。
２）セルソーターを用いて、Ca2+センサー（YC-Nano50）の恒常発現細胞(HSY)を作製した。この細胞の長時間Ca2+イメージングを行ったところ、無刺激でのCa2+オシレーションが観察されたが、Ca2+オシレーションの頻度は容量性Ca2+流入を阻害するLa3+の添加により抑制された。
３）アデノ随伴ウイルス(AAV)と同様に長期的遺伝子発現が期待され、AAVよりも発現効率が高いとされるレンチウイルスを用いてCa2+センサーを発現させる事を試みた。レンチウイルスベクターを用いて唾液腺由来培養細胞(HSY)にYC-Nano50を発現させ、蛍光を観察した。蛍光強度及び発現細胞数は導入後徐々に増加し、導入1か月後でも蛍光が観察されたことから、長期的発現実験に使用できることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１）蛍光FRETを用いたcAMPセンサーのプラスミドベクターを現在作製中である。このプラスミドベクターの完成後、アデノウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターの作製に移る予定である。
２）超高感度Ca2+センサーのプラスミドベクターを作製した。このウイルスベクターの作製に取りかかっており、完成次第動物に導入する。
３）組織スライス標本を用いたシグナル解析の実験系が確立されておらず、この部分の研究が遅れている。
４）GFP-LifeactならびにGFP標識SNAREタンパク発現ベクターの作製が遅れている。
５）ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンの前投与により、水分泌だけでなくアミラーゼ分泌も増加していることが示され、この部分の研究が計画より進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）ウイルスベクターを用いて蛍光FRET式 cAMPセンサーを唾液腺に発現させ、単離顎下腺細胞を用いてアゴニスト刺激によるcAMPシグナルを検出する。
２）GFP-Lifeactの動態とCa2+シグナルとの同時解析を行うことを予定している。このため、赤色側の蛍光を発する高感度Ca2+センサー発現アデノウイルスベクターを用いてこのCa2+センサーを唾液腺組織に発現させ、単離顎下腺細胞を調製してアゴニスト刺激によるCa2+シグナルを確認する。その後、GFP-Lifeactと赤色Ca2+センサーを同時に唾液腺に発現させ、単離細胞を用いてGFP-Lifeactの動態とCa2+シグナルとの同時解析を行う。
３）現在のシステムではin vivoでの分泌過程のリアルタイム解析が困難であるため、顎下腺から単離腺房細胞を調製してアミラーゼ分泌を起こす刺激（イソプレナリン）によるCa2+やcAMPシグナルを解析する。
４）完成したレンチウイルスベクターを用いて顎下腺に各種センサーを発現させ、刺激によるシグナル動態をin vitroあるいはin vivoで解析する。
５）ピロカルピンの前投与による唾液分泌量及びアミラーゼ分泌量が増加するメカニズムを明らかにするため、Ca2+およびcAMPシグナルをリアルタイムで解析する。
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| Causes of Carryover |
GFP-SNAREタンパク質発現ベクターの作製が遅れており、この部分で当該金額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
国内学会での研究発表のための旅費を使用する。ベクター作製費、動物購入費、試薬購入費として物品費を使用する。
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