2016 Fiscal Year Annual Research Report
Real-time analyses of exocytosis and Ca2+ and cAMP responses
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26462820
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (00305913)
谷村 明彦 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (70217149)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 唾液分泌 / アミラーゼ分泌 / Ca2+シグナル / レンチウイルス / Ca2+センサー / cAMPセンサー / ピロカルピン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、唾液腺細胞における開口分泌と、Ca2+ならびにcAMPシグナル、SNAREタンパクの関わりを明らかにして、唾液腺における開口分泌の分子基盤を解明することを目的とする。
１）Ca2+センサー（YC-Nano50, G-GECO, R-GECO）を発現するレンチウイルスベクターを作製し、これらを用いて唾液腺由来培養細胞（HSY）に上記のCa2+センサーを発現させた。蛍光強度および発現細胞数はベクター導入後徐々に増加し、導入1か月後でも発現していた。このレンチウイルスベクターをラットの顎下腺から逆行性に注入し、顎下腺にCa2+センサーを発現させた。約5か月後、in vivoにおいてアセチルコリン刺激によるCa2+応答が観察されたことから、レンチウイルスベクターを用いた長期的発現実験が可能であることが示された。
２）cAMPセンサー（Flamindo2）を培養細胞に発現させ、β刺激によるcAMPシグナル変化の測定に成功した。このFlamindo2とR-GECOを同時に発現させることで、cAMPとCa2+シグナルの同時解析が可能となった。
３）ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンを前投与（1週間前および1日前）すると、非前投与のコントロールと比較して、唾液分泌量およびアミラーゼ分泌量が増加していた。顎下腺にYC-Nano50を発現させ、in vivoでCa2+応答を測定すると、ピロカルピン前投与群ではコントロールに比べてアセチルコリン感受性が増大する傾向にあった。
４）この亢進作用には遺伝子発現変化を介することが考えられたため、次世代シークエンスによる遺伝子発現の網羅的解析を行った。非前投与群に比べて前投与群で2倍以上発現変化する遺伝子が顎下腺で120、脳で50遺伝子検出された。いくつかの遺伝子に対して定量PCRを行い、発現量変化の再現性を確認した。
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