2014 Fiscal Year Research-status Report
In vivoミクロイメージングによる唾液腺細胞のCa2+応答と分泌機構の解明
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26462821
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石井 久淑 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (00275489)
森田 貴雄 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (20326549)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞内カルシウム / 唾液分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、生体内における唾液腺腺房細胞の細胞内Ca2+はどのように変化し、唾液分泌に関わっているかを明らかにする事を目的とする。本年度は生きた動物における唾液腺のCa2+応答を細胞レベルで測定するミクロイメージングを試み、Ca2+応答と唾液分泌との関係について解析を行った。
１）これまでに我々は、アセチルコリン（ACh）刺激が顎下腺全体に特徴的なCa2+オシレーションを起こすこと見出した。本年度は他の受容体刺激薬によるCa2+応答の可視化により、Ca2+オシレーションがACh特有の反応である事が明らかとなった。また我々の確立した唾液分泌のリアルタイムモニタリング法により、Ca2+オシレーションと唾液分泌が同期することが明らかとなった。
２）AChによるCa2+オシレーションが細胞レベルで起こるか否か調べるため、唾液腺を専用アームで挙上し、高倍レンズを用いた共焦点レーザー顕微鏡により腺房細胞のCa2+応答のミクロイメーングを試みた。ACh投与による腺房細胞に導入されたCa2+ センサー（YC-Nano）の蛍光比の上昇が観察され、生きた動物における顎下腺の腺房細胞レベルでのCa2+応答の測定に成功した。
３）一方で、挙上法によるイメージングは細胞の縮小などの形態変化による動的アーティファクトを完全に除く事が出来なかったことから、細胞内の空間的な細胞内Ca2+濃度変化の可視化は困難であった。
平成27年度は、より動的アーティファクトを軽減させ、より深い場所の細胞のCa2+応答を解析するため、倒立顕微鏡を用いた多光子レーザー顕微鏡による測定システムにより検討を行う。多光子レーザー顕微鏡で使用するCa2+センサー（G-GECO)を発現するウイルスベクターは平成26年度に作製済みである（研究協力者：村田佳織、高橋亜友美）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
共焦点レーザー顕微鏡と高倍率レンズを用いたミクロイメージングを試みた。腺房細胞マーカーであるLysotrackerRed染色によりCa2+センサーが導入された細胞が腺房細胞である事を確認し、腺房細胞におけるAChによるCa2+センサーの蛍光比の上昇の観察に成功した。この際、測定する顎下腺は専用アームにより挙上し、この方法により動物の呼吸などによるアーティファクトをほぼ除く事ができた。一方で、Ca2+応答を起こす刺激は、腺房細胞のシュリンケージ（細胞縮小）によるアーティファクトの影響により、挙上法では個々の腺房細胞の空間的な変化を正確に可視化することが困難であった。この問題点を解消するため、倒立顕微鏡を用いた多光子レーザー顕微鏡を用いて、動物を伏臥位した状態で顎下腺を固定する事により測定を試みる。この方法ではより強固に唾液腺を固定できるため、細胞形態変化による影響をさらに軽減できるものと考える。また多光子レーザー顕微鏡はより深い部位での観察出来ることから、唾液腺表面でなく、神経終末により近い部位のCa2+測定が可能になることが期待される。多光子レーザー顕微鏡の測定系ではFRET型のCa2+センサー（YC-Nano）が使用出来ないため、蛍光強度が増大するタイプのセンサー（G-GECO）を用いる。当該年度においてG-GECO導入ベクターの作製を同時に行っており、導入用のウイルスベクターはすでに完成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
共焦点レーザー顕微鏡を用いたミクロイメージング法に動的アーティファクトを軽減する更なる改良を行い、顎下腺における ACh刺激によるCa2+オシレーションについて検討を行う。また組織切片を用いた方法により薬物刺激で起こる腺房細胞のCa2+応答について組織レベルでの解析を検討する。
さらに、G-GECOを使った多光子レーザー顕微鏡によるミクロイメージングにより、生きた動物の唾液腺における腺房細胞のCa2+応答の時間・空間的変化の可視化を試みる。
また神経刺激（舌神経）による顎下腺のCa2+応答のマクロイメージング法は、共同研究者の石井とともに既に確立している。今後は、舌神経に加え、中枢刺激によるCa2+応答と唾液分泌の関係についても検討を行う。
これらの解析により、神経刺激と薬物刺激による顎下腺Ca2+応答の違いを明らかにするとともに、さらにミクロイメージングによる細胞レベルでの反応性を比較解析することで、薬物刺激と神経刺激による唾液分泌機構についても検討する。
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| Causes of Carryover |
当該年度は中枢刺激用電極の挿入に用いる脳固定装置（468千円）を手技の訓練のため早期に導入する予定であった。しかし、ミクロイメージングの測定条件の調整に時間を要したことから、中枢刺激による実験手技の訓練時間を取る事が出来ず、この機器の購入を当該年度では見送った。その分、実験に使用する消耗品等に予算を使用した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は、脳固定装置に加え、試薬、プラスチック製品等の消耗品の購入費として使用する。また今年度は2～3回の学会（国内学会および国際学会）での発表を予定しており、研究費はこれらの学会参加の旅費等としても使用する。
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