2015 Fiscal Year Research-status Report
人工ヌクレアーゼを用いた歯根膜細胞の細胞外マトリックス分泌機構の解明
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26462822
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡山 三紀 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30382500)
荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (40306254)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / TALEN / HAP1細胞 / SNAP23 / SNARE / 歯根膜細胞 / 人工ヌクレアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工ヌクレアーゼTALENを用い、HeLa細胞のSNAP23遺伝子のノックアウトに挑戦したが、細胞の染色体数が2本とは限らず、また、常に3の倍数の塩基を欠失したインフレーム変異を含み、完全KO細胞の確立には至らなかった。そこで、ヒトの骨髄性白血病細胞に由来する、染色体数がほぼ1セット(n)のハプロイド細胞HAP1細胞と、第3世代の人口ヌクレアーゼであるCRISPR/Cas9を用い、SNAP23遺伝子のノックアウトに挑戦し、KO細胞の確立に成功した。
SNAP23遺伝子をKOしたHAP1細胞は、正常細胞より増殖速度が約40％低下したが、構成的分泌の測定用に導入したウミホタル・ルシフェラーゼCLucと、GFP標識したヒト成長ホルモンhGH-GFPの分泌では､正常細胞との差は認められなかった。KO細胞と正常細胞の遺伝子発現の違いをDNAマイクロアレイで比較したところ、SNARE関連遺伝子の発現には差が見られなかったものの、多数の遺伝子に大幅な発現低下と一部に発現増加が認められた。エクソーム解析では、CRISPR/Cas9のオフターゲット効果は認められなかった。そこで、Pathway解析によって発現の変化した遺伝子間の関連を調べたが、これまでに蓄積されたデータからは、相互の関連性は確認できなかった。
今後、SNAP23-GFPベクターの導入によるレスキュー実験と、他のSNAREファミリー遺伝子による代償作用の有無について検討し､論文作成にかかる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工ヌクレアーゼCRISPR/Cas9を用い、分泌関連遺伝子SNAP23をノックアウトした細胞(HAP1細胞)を確立し、様々な解析が進みつつあるから。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集実験により、HAP1細胞のSNAP23遺伝子をノックアウトすることができた。DNAマイクロアレイ解析の結果、多数の遺伝子発現に変化が見られたが、SNAP23が属するSNARE遺伝子群の発現には変化が見られなかった。そこで、今後2つの実験を追加して論文完成を目指すとともに、この技術を歯根膜細胞に応用する。追加実験は、１）SNAP23の発現を戻し、他の遺伝子発現が回復することを確認する。２）SNARE遺伝子の中に、SNAP23の代償作用を示すものが存在しないかどうか確認する。さらに、今回遺伝子ノックアウトに成功したSNAP23のCRISPR/Cas9ベクターを歯根膜細胞に導入し、ノックアウト細胞を確立する。
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| Causes of Carryover |
次年度、レスキュー実験後のDNAマイクロアレー解析等、外部に委託する解析費用がかさむ可能性があり、一部の研究費用をそのために残した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
約50万円の繰越額は、遺伝子発現解析、エクソーム解析等、外部委託解析の費用として使用する。
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