2016 Fiscal Year Annual Research Report
Application of artificial endonucleases to the exocytotic mechanism of extracellular matrix proteins from periodontal ligament cells.
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26462822
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 名誉教授 (40095336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡山 三紀 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30382500)
荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 准教授 (40306254)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 遺伝子ノックアウト / CRISPR/Cas9 / TALEN / SNARE / SNAP23 / HAP1細胞 / 歯根膜細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、最新の遺伝子改変技術である。本研究では、第２世代のゲノム編集技術TALENと第3世代のCRISPR/Cas9を用い、歯根膜細胞のSNAREファミリー遺伝子をノックアウトし、その機能を明らかにすることを目的とした。その前段階として、培養細胞を用い、遺伝子KOを試みたところ、HeLa細胞など長期間培養されてきたガン細胞では、個々の染色体が実際に何本存在するか不明であり、遺伝子ノックアウトのモデル細胞として使用した場合、多大な不都合を生じた。そこで、生殖細胞のように染色体を1セット(n)しかもたないHAP1細胞を用い、CRISPR/Cas9法で遺伝子KOを行った結果、効率的な遺伝子KOが可能となった。
約40種類存在するSNAREの中から、SNAP25の普遍型相同分子であり、他のSNAREによる代替可能性が極めて低いと予想されたSNAP23を選び、遺伝子KO細胞のクローニングを行った。得られたSNAP23 KO細胞は、正常細胞と比べ、細胞増殖と構成的分泌に大きな違いが見られないことから、SNAP23はこれらの過程に必須ではないことが明らかとなった。SNAP23 KOマウスは胎生3.5日目に死滅することから、SNAP23は初期発生に関与していると想像される。実際、DNAマイクロアレイ解析の結果、SNAP23 KO細胞では多くの遺伝子に著しい発現低下が認められた。しかし、pathway解析では、発現が低下した遺伝子相互間ならびにSNAP23遺伝子との関連は認められなかった。また、SNAP23 KO細胞にSNAP23発現ベクターを導入し、発現低下が認められたいくつかの遺伝子を選び、定量PCR解析を行ったが、遺伝子発現は回復せず、SNAP23 KOとの直接的な関係は否定された。さらなる研究が必要である。本研究の結果をまとめた論文は、現在投稿中である。
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