2014 Fiscal Year Research-status Report
バイオフィルム制御の概念転換の必要性の提示とマトリックスを標的とした制御戦略開発
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26462876
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
竹中 彰治 新潟大学, 医歯学系, 助教 (50313549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大島 勇人 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70251824)
寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
小田 真隆 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00412403)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / 共焦点レーザー顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、これまでの細菌を標的とした殺菌効果に頼ったバイオフィルム制御から、マトリックスを標的とした抗菌成分に頼らない新しい制御法への戦略の転換の必要性を提言するとともに、バイオフィルムの剥離・分散効果に主眼を置いた新しいバイオフィルム制御法を開発することを目的としている。
これまで、口腔バイオフィルムに洗口液をはじめとした抗菌成分を作用させても、バイオフィルム深層部への抗菌成分の浸透遅延が起こるだけでなく、バイオフィルム構造体が付着界面に残存することを報告してきた。今回、付着界面に残存したバイオフィルム構造体への二次バイオフィルム形成の促進機構を明らかにするために人工バイオフィルムモデルと共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光イメージング法により観察、解析した。
フローセル培養系を用いてレジンディスク上にStreptococcus mutans 人工バイオフィルムを形成させた後、イソプロピルアルコールで処理することにより死菌構造体を作製した。その構造体に対し、対数増殖期の同一株培養液を再度還流させたのち、蛍光染色により生死分別（二次付着菌と死菌構造体の染め分け）を行ったところ、死菌構造体の増加とともに二次付着した生菌数の増加が観察された。さらに、colony count法による生菌数測定ならびにPCR- Invader法による総菌数計測からも、生菌数と総菌数との間には正の相関関係が認められ、死菌構造体の増加に従いバイオフィルム再形成も促進されることが明らかとなった。
この結果から、抗菌成分に頼ったバイオフィルム制御は付着界面にバイオフィルム構造体を残す結果、バイオフィルム再形成を助長させる可能性があり、常在菌が存在する特殊な器官である口腔内においてはバイオフィルムの剥離・分散が必要であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は短期目標である、これまでの細菌を標的とした殺菌効果に頼ったバイオフィルム制御から、マトリックスを標的とした抗菌成分に頼らない新しい制御法への戦略の転換の必要性の提示のためのエビデンスの蓄積を行った。今後、バイオフィルム再形成過程における遺伝子発現機構の変化を解析するとともに、バイオフィルムを効果的に剥離分散する方策の検討をおこなう。これは３年間の研究計画の予定どおり進行しており、順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は抗菌成分により処理されてもなお、バイオフィルム内部で生存している細菌が生理学的多様性を示すかどうかを生化学的、遺伝子学的に検討するとともに、付着界面に残存したバイオフィルム構造体が新たなバイオフィルム形成に物理的な付着促進だけでなく、遺伝子伝播や付着因子を放出させるかどうかを検討する。具体的には、影響因子を単純化するために、はじめは単一細菌による人工バイオフィルムを形成させたのち、種々の抗菌成分をMBC濃度で短時間、あるいはsub-MIC濃度で作用させ、バイオフィルム深層部の細菌を生存させたままストレスをかけ、反応の変化の有無を検討する。また、バイオフィルム再形成への影響として、死菌構造体から放出されるであろう菌体外DNAあるいは膜結合タンパクの関与が考えられる。こちらもはじめはvitroにて浮遊菌に種々の因子を作用させ、増殖促進あるいはバイオフィルム形成促進因子となりえるか検討する。
同時に、バイオフィルムの剥離・分散効果に主眼を置いた新しいバイオフィルム制御法の開発に取りかかる。現在想定している口腔への応用可能な各種物質による複合バイオフィルムへの剥離・分散効果をvitroで検討する。口腔内では唾液で付着界面から物質が剥離しやすい上、嚥下で薄まるため、貯留効果を高める製剤化の検討も行う必要がある。
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| Causes of Carryover |
余剰額は研究遂行にかかる物品費（消耗品費）であり、次年度以降に試薬、蛍光色素、凍結切片作製器具等多額の支出が予想されるため、初年度配分額は初年度の実験計画が遂行可能な物品購入にのみ使用し、余剰額を次年度に繰り越すようにしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
翌年度は凍結切片の作製に多額の費用がかかる予定となっている。本年度の余剰額を使用して、データの信頼性を高めるために各実験の再現回数の増加をはかる。
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