2014 Fiscal Year Research-status Report
難治性根尖性歯周炎におけるEpstein-Barrウイルスの再活性化に関する検討
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26462897
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
武市 収 日本大学, 歯学部, 准教授 (10277460)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 難治性根尖性歯周炎 / 歯根肉芽種 / Epstein-Barr ウイルス / EBER / 定量的PCR法 / in situ hybridization法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.供試試料：歯根嚢胞と臨床診断された患者40名から、根尖病巣組織を摘出した。また、埋伏智歯抜去時に健常歯肉10例を採取した。
2.病理組織学的検索：ヘマトキシリンーエオジン重染色を行ったところ、40例中32例に扁平上皮とコレステリン空隙を認めず、結合組織中に幼弱な毛細血管と多数の炎症性細胞浸潤を認め、歯根肉芽種と診断し、本研究に供した。また、健常歯肉10例を染色した結果、重層扁平上皮を認め、上皮直下の結合組織に少量の円形細胞浸潤を認めた。
3.real-time PCR法による定量的なEBV DNAの検出：（検量線の作製）EBVからDNAを抽出後EBVのコピー数を算出し、1X10の２乗から1X10の７乗コピーまで10倍ずつ段階希釈したものを準備した。その後、EBV特異的PCRプライマーを用いてreal-time PCR法を行い、片対数グラフを用いて検量線を作製した。
（歯根肉芽種中のEBV DNAの定量）歯根肉芽種からDNAを抽出し、段階希釈したEBV DNAと同時にreal-time PCR法を行った。検量線を元に歯根肉芽種中のEBVのコピー数を算出したところ、32例中25例（78.1％）にEBV DNAを検出し、そのコピー数は平均8688.01であった。なお、健常歯肉10例を同様に検索したところ、全ての試料でEBVは検出されなかった。
4.in situ hybridization法によるEBV-encoded small RNA (EBER)の検索：（リボプローブの作製）EBER mRNAを制限酵素で消化したのち、100bp程度の断片を取り出し、T3およびT7 RNAプロモーターを有するベクターに結合させた。このベクターに対してジゴキシゲニン-dUTP存在下でT3またはT7ポリメラーゼを作用させ、ジゴキシゲニンを標識したリボプローブを回収した。これを用いて次年度はin situ hybridization法を行い、EBER発現細胞の検索を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
試料の採取が順調にすすみ、40例のサンプルが供試できたため、計画的に研究を遂行することができた。研究の手技については、申請者がこれまで行ってきた病理組織学的、分子生物学的手法を中心に行ったため、試料の解析を行う上で問題が発生することがなく、適切に検索することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、難治性根尖性歯周炎患者試料の約80％からEBV DNAを検出することができた。しかし、EBVが感染しているかどうかは未だに不明である。次年度はEBV感染の有無、および感染細胞の同定を行うことを目的とし、EBV感染の指標とされているEBV-encoded small RNA (EBER)の解析を行うことを予定している。
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