2014 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子導入とナノバイオマテリアルを応用した新規骨組織再生療法
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26462932
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
近藤 尚知 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (70343150)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石崎 明 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (20356439)
平 雅之 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (60179398)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ナノサイズ / ハイドロキシアパタイト / コラーゲン / 骨組織 / 再生 / 遺伝子導入 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デンタルインプラントによる機能回復は治療効果も患者満足度も高いが、骨量の少ない場合にはインプラントの埋入が不可能で、必ずしも容易に適用できるわけではない。超高齢社会となった我が国では、上記問題の改善がさらに大きな課題となることが予想される。本研究の目的は、ナノレベルの骨置換性バイオマテリアルよってスペースメーキングを行うとともに、遺伝子導入により骨芽細胞を直接組織中に誘導し、抜歯後喪失されていく骨組織を維持すること、または失われた骨組織を短期間に再生することにある。
現在までに、ナノサイズのアパタイト/コラーゲン複合体（n-HAP/Col）スポンジがin vitroの培養実験で、骨芽細胞の分化を促進する事を確認した。また、in vivoにおける検討では、０℃では液状で、２０℃では固形化するコラーゲン材料を皮下へ注射して、その操作性と生体反応を観察してきた。一方で、n-HAP粒子を中和したI型コラーゲンに混練し、ニュートンプレスしたn-HAP/Col試料も作成した。このn-HAP/Colを10週齢の雄性Wistarラットの頭蓋骨に骨欠損部を形成し、埋入後、骨組織再生の状態を観察した。
マイクロCTによって、骨欠損部における新生骨形成の程度をエックス線不透過度より評価した結果、n-HAP/Colはラット骨欠損部において経時的にマイクロCT像の不透過度を増加させた。術後8週飼育後、蛍光二重ラべリング（テトラサイクリンおよびカルセイン腹腔内注射）を施した。安楽死後、欠損部を含むラット頭部をでブロック状に切り出し、Villanueva染色後、非脱灰薄切標本を作成した。蛍光顕微鏡観察によって組織像観察を行い、材料起因の骨修復・再生能を評価した。組織像から。n-HAP/Colは、骨欠損部において多核巨細胞によって広範に吸収／代謝され、類骨と新生骨の形成を活発に誘導することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までに、培養細胞を用いた検討において、ナノサイズのアパタイト/コラーゲン複合体（n-HAP/Colが、骨分化マーカーの発現を促進、すなわち骨芽細胞の分化を促進する事を確認してきた。また、低侵襲な骨組織再生療法の開発を目標に、材料に関する検討を行ってきた。現在までに各種のコラーゲンゲルの性状を検証し、注射によって生体内に注入が可能な材料を検索してきた。０℃では液状で、２０℃では固形化するコラーゲン材料をその候補として用い、皮下へ注射して、その操作性と生体反応を観察してきた。それと並行して、n-HAP粒子を中和したI型コラーゲンに混練後プレス加工したn-HAP/Col試料も作成した。このn-HAP/Colを10週齢の雄性Wistarラットの頭蓋骨に骨欠損部を形成し、埋入後、骨組織再生の状態をマイクロCTを用いて観察した。骨欠損部におけるエックス線不透過度は経時的に上昇し、n-HAP/Colはラット骨欠損部において骨組織の再生を促進させていることが示唆された。術後8週飼育後、蛍光二重ラべリング（テトラサイクリンおよびカルセイン腹腔内注射）を施した後、安楽死させ、欠損部を含むラット頭部を切り出し、Villanueva染色後、非脱灰薄切標本を作成した。蛍光顕微鏡観察によって組織像観察を行った。その結果から、材料起因の骨修復・再生能を評価した。組織切片を各種観察法によって検索した結果、n-HAP/Colは、骨欠損部において多核巨細胞によって広範に吸収／代謝され、類骨と新生骨の形成を促進することが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
低侵襲な骨組織再生療法の開発を目標に、材料に関する検討を行い、現在までに各種のコラーゲンゲルの性状を検証し、注射によって生体内に注入が可能な材料を検索してきた。現在までのところ、０℃では液状で、２０℃では固形化するコラーゲン材料をその候補として用い、皮下へ注射して、その操作性と生体反応を観察してきた。しかしながら、本材料は、必ずしも操作性が良いとは言えず、敏感に温度に反応し、固化するので、本材料注入のタイミングが重要であり、実験のスキルを要するため、当初より計画がやや遅れている。今後は、更なる材料の検索と共に遺伝子導入に関する検索も行っていく。
現在までに、遺伝子導入に用いる骨誘導タンパク(Bone morphogenetic protein-2: BMP-2)のコンストラクトの設計を見直し、より多くのタンパクを分泌できるものを作成した。今後はこのコンストラクトを用いて、骨欠損部組織への遺伝子導入効率、と骨組織再生に対する影響を検索していく予定である。現在までにおこなってきたラットの頭蓋に骨欠損を形成し、n-HAP/Colを埋入後、どのような変化があるかを、マイクロCTでファーストスクリーニングを行う。その後、変化がおおきいと思われるサンプルに対しては、組織切片を作成して、その詳細を観察・評価する予定である。GFPを組み込んだコンストラクトの使用によって、遺伝子の導入効率の評価もある程度化可能となっている。
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| Causes of Carryover |
共同研究の兼ね合いで、分担研究者が購入予定であった消耗品を研究代表者が購入し、使用したほうが効率が良いと判断したため、研究代表者の消耗品費の使用状況が予定外に多くなったものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、共同研究との兼ね合いで、補てんが可能である。
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