紫外線照射したチタン製インプラントの免疫応答の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462980
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 月村 直樹 日本大学, 歯学部, 准教授 (10301558)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 萩原 芳幸 日本大学, 歯学部, 准教授 (00228389) ; 本田 和也 日本大学, 歯学部, 教授 (30199567) ; 池田 貴之 日本大学, 歯学部, 助教 (30366603) ; 本田 雅規 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70361623)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: チタン / インプラント / オッセオインテグレーション / 紫外線 / マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

骨インプラントとして用いられるチタンの生体親和性が、経時的に低下するチタンのエイジングが明らかにされ、このチタンのエイジングに対する解決策として光機能化が報告されている。チタンのエイジングは、チタン表面に炭素原子が付着し、表面が疎水性となり、骨に荷電した表面となり。その結果体親和性が低下する現象である。
一方、光機能化は、インプラント埋入の直前に特定の波長と強度を有する紫外線をインプラント他に表面に照射する表面改質法である。これまでの研究では、骨芽細胞を光機能化したチタン上で培養した場合、未処理のものと比較して良好な細胞接着と増殖及び分化が観察されていることが報告されている。
我々は“光機能化によって改質されたチタンは未処理のチタンと比較して生体に対する異物反応が少なく過剰な免疫応答を起こさない”という仮説のもと、特に初期の免疫応答において重要な役割持つマクロファージに注目して以下の実験をおこなった
本年度は、はじめにin vitro の実験系として、骨髄由来マクロファージを未処理と光機能化したそれぞれのチタンディスク上で培養し、２４時間後に培養上清中のサイトカインを定量し免疫応答を確認することとした。
次にin vivoの実験系として、ラット大腿骨に直径1mm、長径15mmのチタン製ミニインプラントを埋入し、24時間後にインプラント表面に付着したマクロファージを蛍光免疫染色により観察する。in vitro、in vivoの両者を検討した結果、興味深い結果が得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

はじめにin vitro の実験系として、骨髄由来マクロファージを未処理と光機能化したそれぞれのチタンディスク上で培養し、２４時間後に培養上清中のサイトカインを定量した。その結果、光機能化群は未処理のコントロール群と比較して、上清中のProinflammatory cytokine であるTNF-αは優位に少なく、一方でantiinflammatory cytokine であるIL-10は優位に多いという結果が得られた。TNF-αは骨芽細胞の分化を抑制し、破骨細胞の分化を促進するという報告があり、IL-10は治癒を促進する作用があるため、今回得られた二群間の違いはオッセオインテグレーションの獲得において影響を与える可能性がある。
次に、in vivoの実験系として、ラット大腿骨に直径1mm、長径15mmのチタン製ミニインプラントを埋入し、24時間後にインプラント表面に付着したマクロファージを蛍光免疫染色により観察した。今回マクロファージを染色するにあたり、roinflammatory cytokineを分泌し炎症を促進させるM１マクロファージとantiinflammatory cytokineを分泌し炎症を抑制するM２マクロフファージを区別するため、それぞれの特異的表面抗原であるCD68とCD163に対するモノクローナル抗体を用いた。その結果、処理のコントロール群と光機能化群の両方でCD68陽性の細胞が確認された。また、CD163陽性細胞に関しては、光機能化群でのみ多くの陽性細胞が確認された。しかし、今回得られた結果はサンプル数が少ないため、さらなる検討が必要である。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究で、in vitroのサイトカイン定量試験は現状の結果が得られており、一定の成果が得られていると思われる。
一方で、in vivoの実験系は、蛍光免疫染色においてマクロファージを染色するにあたり、roinflammatory cytokineを分泌し炎症を促進させるM１マクロファージとantiinflammatory cytokineを分泌し炎症を抑制するM２マクロフファージを区別するため、CD68とCD163に対するモノクローナル抗体を用いるプロトコールは確立されたと思われる。しかしながら、明瞭な結果を得るには、蛍光免疫染色のさらなる条件設定の検討が必須であり、さらにサンプル数を増やし検討することが必要と思われる。

Causes of Carryover

当初の予定より、消耗品費が安く抑えられたため繰越金が生じた

Expenditure Plan for Carryover Budget

これまでの研究で、in vitroのサイトカイン定量試験は現性の結果が得られており、一定の成果が得られていると思われる一方で、in vivoの実験系は蛍光免染色のプロトコールは確立されたが、明瞭な結果を得るにさらなる条件設定の検討と、サンプル数を増やす事が必要である。本年度は、in vivoの実験系を中心に実験を進めていく。さらに、得た結果をもとに学術会議などでの発表並びに論文としてまとめていくことを考えている。