2015 Fiscal Year Research-status Report
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26462987
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
中塚 美智子 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70368158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
乾 千珠子 (山本千珠子) 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 助教 (00419459)
隈部 俊二 大阪歯科大学, 歯学部, 准教授 (30288774)
細矢 明宏 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (70350824)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 下顎頭 / 軟骨 / 再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
若年性リウマチなどにより下顎頭部の軟骨内骨形成が障害あるいは抑制されると、下顎頭の変形、下顎骨形態や顎顔面の骨格に重篤な影響を及ぼす。下顎頭は表層に線維層および線維軟骨層を有し、再生手法も確立されていないため再生が極めて困難である。本研究では下顎頭欠損部の再生を目指して、ラット脛骨骨髄から採取した細胞を用い、下顎頭の軟骨層を形成する細胞への効率的な分化誘導法について検討している。
平成27年度は線維層および線維軟骨層を形成する細胞培養系の確立を目指すため、ラット脛骨骨髄から細胞を採取後、各種成長因子を添加し、現在分化能を評価中である。
各種成長因子を添加した脛骨骨髄由来間葉系幹細胞の分化誘導および評価を行うため、5週齢Wistar系ラット脛骨から採取した骨髄細胞を初代培養した後、1-2回の継代を経てクライオチューブに播種し、DMEMに1% FBS、1％ ITS、dexamethazone(0.1μM)、sodium pyruvate(1mM)、TGF-β3(10 ng/ml)を添加して軟骨細胞への分化実験を行っている。骨髄細胞は培養dishに接着したものを間葉系幹細胞として実施している。形成された細胞スフェロイドを採取し、凍結して切片を作製した後、軟骨細胞への分化の指標となるアルシアンブルー染色を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
5週齢Wistar系ラット脛骨から採取した骨髄細胞を初代培養した後クライオチューブに播種し、分化誘導後21日、28日に形成された細胞スフェロイドを回収した。現在回収したスフェロイドを凍結してクリオスタットにより厚さ7μmの凍結切片を作製し、軟骨細胞への分化の指標となるアルシアンブルー染色、type II collagen染色等を行っている。
達成度は当初の予定よりやや遅れている。理由として、スフェロイドの良好な形成条件（細胞数、培地等）の探索および検討に時間を要すること、またスフェロイド作製のための細胞培養に時間を要すること、さらに同時並行的に多くの実験ができないことが挙げられる。
スフェロイドの形成はクライオチューブ内で自然発生的に行われており、細胞数が少ないと形成されない。また、実験終了後の細胞回収の手技が不安定で、スフェロイドの形状に影響を与えることも考えられる。このため、現在ゲルを用い、実験終了時にスフェロイドを予めゲルに包埋して回収し、ゲルも含めて一塊で凍結の後切片を作製している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は現在行っているスフェロイド形成三次元培養を確立し、分化誘導後7日、14日、21日、28日に形成された細胞スフェロイドを回収してアルシアンブルー染色、type II collagen染色等を試み、軟骨細胞への分化の確認を早期に行う。また、分化したと考えられる細胞のmRNAを採取し、real time PCRにてI型およびII型コラーゲン、BMP、IGF-I, II、TGF-β3、Sox5,6,9、Runx1,2 mRNAの発現を評価する。
同時にスフェロイド作製に用いた細胞と同一細胞を用いて平面培養を行い、分化誘導後分化誘導後7日、14日、21日、28日にtype II collagen染色を試み、軟骨細胞への分化の確認を行う。その後線維軟骨層の細胞に誘導した細胞をコラーゲンゲルとともにラット頭部皮下へ移植し、21日後に基質形成能をアルシアンブルー染色ならびに免疫組織化学的染色にて評価する。
次にラット脛骨から採取した骨膜細胞を培養し、線維層形成能について評価するため、EGF、bFGFを各1，10，40，80 ng/ml添加した培地で1-28日間培養する。線維層にはIGF-I、IGF-IIが強く発現し、ESFsも多く含まれることから、 I型コラーゲンも含め、これらの遺伝子発現により分化を評価する。
線維軟骨層は椎間板や関節円板と類似の構造を持つため、線維軟骨細胞層の培養条件が難しい場合はそれらからの細胞採取も検討する。
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| Causes of Carryover |
今年度末までに成長因子および実験に用いる培養器具、免疫染色で使用する試薬等を購入しようと考えていたが、予期せず通常業務が多忙を極めたため、計画通りに実験を遂行できず、試薬の購入等も難しくなった。このため残額を使用することができず、次年度使用額が生じることになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は今年度に引き続きラット由来細胞を用いる予定である。このため、ラット購入費として15万円を計上する予定である。また細胞培養およびRT-PCR実施のため、培地やプライマーなど試薬の購入費として30万円、研究成果を発表するため、国内学会(歯科基礎医学会、札幌市)参加費ならびに出張費として計15万円、人件費および謝礼として29万円を計上する予定である。
平成28年度は合計89万円を計上する予定である。
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Research Products
(1 results)
