Regeneration of muscle by introduction of MyoD family gene into adipose-derived stem cells

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26462994
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 坂本 洋右 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (50451745)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 椎葉 正史 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (20301096) ; 鵜澤 一弘 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (30302558)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: MyoD family 遺伝子 / 脂肪幹細胞 / 筋再生

Outline of Annual Research Achievements

本年度、以下の実験を行った。
1)HEK293T細胞を用いてウイルス含有培養上清を作成し、Lenti-X Concentrator(Clontech)を用いて濃縮させた上清にてヒト骨髄幹細胞、ヒト脂肪由来幹細胞、胎児線維芽細胞へ感染させた。
2)Flow cytometryを使用し蛍光タンパク陽性細胞のセレクションを行い、これらのMyoD family遺伝子およびPax-7を導入した陽性細胞において、PCR法を用いてMyoD family遺伝子およびPax-7の発現が亢進していることを確認した。また、Western blot法にて、α-actinin, α-SMAの発現が亢進していることを確認した。
3)筋細胞特異的発現遺伝子群の発現誘導に重要なMyoD4因子の導入を確認した細胞において、骨格筋分化誘導培地を用いて培養したところ筋マーカー(α-actinin、α-SMA)の発現亢進を認めた。
以上、本研究の目的である、ヒト細胞にMyoD family遺伝子を導入し、筋分化を誘導することに成功した。しかし、本研究を通して、改良がさらに必要な点が判明した。すなわち、ヒト脂肪由来幹細胞については、LentiウイルスシステムによるDNA導入効率が悪く、導入後に、他の幹細胞で分化誘導後に認められるような増殖速度減少も認められ、培養が困難であった点である。伝子導入効率の改善の問題に関しては、遺伝子を導入する細胞を選択する際に、導入系との相性をチェックして対象細胞種を選択することにより解決することが出来ると考えられた。また、導入遺伝子の種類、導入細胞の種類などにかかわらず、幹細胞への遺伝子導入を行い分化誘導を行うと、導入後の細胞の増殖が遅くなるため、長期的かつ安定的に培養できるような、分化誘導用の培養法を改良・確立することが必要であると考えられた。