再生前駆細胞と生体内成熟促進因子を活用した新規軟骨再生法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462996
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 菅野 勇樹 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80451813)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30344451) ; 森 良之 自治医科大学, 医学部, 教授 (70251296) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 再生前駆細胞 / 成熟促進因子 / 軟骨再生

Outline of Annual Research Achievements

移植母床からの成熟促進の確認について：成熟促進因子の評価を行うために、生体からの液性成分や細胞成分の採取が容易な腹腔内移植を検討した。まず、培養マウス軟骨細胞を播種したPPプレートをヌードマウス(6週齡雄、N=24)の腹腔内に移植した。移植後1、2、8、16 週でPPプレートを摘出し、軟骨再生を確認した。さらにPPプレートの回収とともに、ヌードマウス腹腔から腹水を回収し、腹水上清と腹水細胞を遠心分離。腹水上清ならびに腹水細胞をヒト軟骨細胞と共培養し、一週間培養後、軟骨細胞の遺伝子発現をRT-PCRで評価。I型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲン、アグリカン、Runx2などを評価し、成熟促進因子の発現、分泌を確認した。
成熟促進因子の同定：採取した腹水細胞のmRNAにおいてマイクロアレイ法で発現変化を網羅的に検索し、対照群（PPプレートのみを移植）の腹水細胞と比較して、軟骨の成熟を強力に誘導する遺伝子を同定した。また腹水上清中のタンパク質についてはプロテオーム解析を実施し、同様に対照群の腹水上清と比較して、軟骨の成熟を強力に促進する因子を同定した。
再生前駆細胞ならびに成熟促進因子を活用したヒト細胞由来再生軟骨組織の検証：ヒト軟骨細胞は手術時に従来は破棄されていた組織を患者の同意のもと回収して単離した。軟骨細胞は、ヒト耳介より約0.5g の軟骨を採取し、コラゲナーゼ処理で軟骨細胞を単離し培養皿に播種して、10%FBS含有培養液で培養を行った。この細胞を用いて成熟促進因子を含有した培養液でin vitroで培養し、軟骨再生を誘導した。比較対照には、再生前駆細胞を用いない群や成熟促進因子を用いない培養群などを用いた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画書通り、④移植母床からの成熟促進の確認⑤成熟促進因子の同定⑥再生前駆細胞ならびに成熟促進因子を活用したヒト細胞由来再生軟骨組織の検証についてはおおむね結果が出ているが、
⑦ビーグルを用いた軟骨再生モデルでの実証の結果がまだ出ていない。

Strategy for Future Research Activity

ビーグルを用いた軟骨再生モデルでの実証を行う。ビーグル(6ヶ月齢雄、N=3）の耳介軟骨より軟骨細胞を採取し、③項の分取法で細胞を準備しPLLA多孔体足場素材(20x10x3 mm) に投与し、成熟促進因子を添加した培養液で培養し、組織成熟を図る。③項に準じ、軟骨再生を評価するとともに、細胞を採取したビーグルで背部皮下移植モデルを作製し、8、24週で移植組織を摘出する。評価は③項に準じる。なお、比較対照には、再生前駆細胞を用いない群や成熟促進因子を用いない培養群などを用いる。

Causes of Carryover

ビーグルを用いた軟骨再生モデルでの実証に時間を要し、研究に遅れが出たため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度にずれ込んだものに使用する。