腫瘍関連マクロファージによる口腔癌の顎骨浸潤メカニズムの解明と新たな治療法の確立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463024
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 里見 貴史 東京医科大学, 医学部, 准教授 (70276921)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 通秀 東京医科大学, 医学部, 助教 (00421066) ; 近津 大地 東京医科大学, 医学部, 教授 (30343122) ; 渡辺 正人 東京医科大学, 医学部, 講師 (40349460) ; 虻川 東嗣 東京医科大学, 医学部, 助教 (50453717) ; 藤川 考 東京医科大学, 医学部, 兼任助教 (60322468) ; 長尾 俊孝 東京医科大学, 医学部, 教授 (90276709)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 顎骨浸潤 / 腫瘍関連マクロファージ / 口腔癌

Outline of Annual Research Achievements

顎骨浸潤能の異なる２種類のマウス同系扁平上皮癌細胞（SCCⅦ, NR-S1）における腫瘍関連マクロファージ（Tumor-associated macrophage:TAM）の特に顎骨浸潤部におけるVEGF過剰発現による血管新生促進作用、CSF-1/CSF-1Rシグナルによる活性作用に着目し、その局在と役割について解明する。また、顎骨浸潤モデルに対して、CSF-1R阻害剤を投与しCSF-1/CSF-1Rシグナルを抑制することによる、①TAMおよび前破骨細胞の活性抑制効果、②顎骨浸潤部周囲の過剰血管新生抑制効果、③顎骨浸潤抑制効果、④抗腫瘍効果を解析することを目的にした研究である。
平成26年度は、PTHrP mRNA ，COX-2 mRNA発現量の異なる２種類のマウス扁平上皮癌（NR-S1細胞株，SCCⅦ細胞株）を用いてC3H/Heマウスにおいて顎骨浸潤モデルを作製した。（PTHrP mRNA ：NR-S1細胞株＞SCCⅦ細胞株　約３倍、　COX-2 mRNA：SCCⅦ細胞株＞NR-S1細胞株　約２倍）
顎骨浸潤モデルの作製方法は、NR-S1細胞株，SCCⅦ細胞株とも2×107/mlに調整し、C3H/Heマウスの右咬筋内に50μl移植して経時的な腫瘍の顎骨浸潤を評価した。実験群は、①NR-S1群　②NR-S1＋COX-2inhibitor投与群　③SCCⅦ群　④SCCⅦ＋COX-2inhibitor投与群の４群とした。腫瘍増殖は、③SCCⅦ群で最も著明で、②NR-S1＋COX-2inhibitor投与群で最も緩慢であった。現在、顎骨浸潤部における腫瘍関連マクロファージを病理組織学的に検索中である。腫瘍関連マクロファージの評価は、特異マーカーであるCD163およびCD204の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて、発現部位や顎骨浸潤および腫瘍との位置関係等を解析中である。また、詳細な局在性を明らかにするため、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する予定である。また、CSF-1R(CD115)の発現についても同様に、局在性や顎骨浸潤部および腫瘍細胞との関連性を検討する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は、口腔癌の顎骨浸潤部における腫瘍関連マクロファージの役割を検討することである。今後、研究を推進する上で、顎骨浸潤部におけるVEGF過剰発現を解析する必要があり、なかでもCOX-2が重要な因子であるため以下の実験を平成26年度に行った。まず、C3H/HeマウスとCOX-2ノックアウトマウスの双方で顎骨浸潤モデルの作製を試みた。マウス扁平上皮癌（NR-S1細胞株、SCCⅦ細胞株）を移植した顎骨浸潤モデルの実験系の確立を目指した。結果、COX-2ノックアウトマウスでは移植癌細胞は生着せず、顎骨浸潤モデルの実験系はC3H/Heマウスで確立した。そのため、マウス扁平上皮癌で、PTHrPmRNA, COX-2mRNAともに発現量が異なるNR-S1細胞株とSCCⅦ細胞株を移植した顎骨浸潤・骨破壊モデルにCOX-2inhibitorを投与し、抗腫瘍効果、顎骨浸潤抑制効果を比較検討した。実験では、COX-2inhibitorを予定期間投与できないといった失敗が何度か繰り返されたが、最終的には予定通りに遂行でき、思ったような結果が得られた。実験群は、①NR-S1群　②NR-S1＋COX-2inhibitor投与群　③SCCⅦ群　④SCCⅦ＋COX-2inhibitor投与群の４群とした。一回の実験に約２か月を要し、合計３回の実験を行った。腫瘍増殖は、③SCCⅦ群で最も著明で、②NR-S1＋COX-2inhibitor投与群で最も緩慢であった。現在、各群の顎骨浸潤部をマイクロCTによる３次元的形態を計測中であり、また、骨芽細胞、破骨細胞、腫瘍関連マクロファージの病理組織学的検討のための切片を作製中である。

Strategy for Future Research Activity

現在、癌治療（骨浸潤・骨転移）におけるBP製剤などの研究が種々の診療科で基礎的あるいは臨床的に進められている。口腔癌の顎骨浸潤を抑制する鍵は、破骨細胞の誘導分化に働く様々なサイトカインの働きや腫瘍関連マクロファージ（Tumor-associated macrophage:TAM）の働きやVEGF過剰発現のメカニズムを解明することである。なかでも今回注目しているTAMの働きやVEGF過剰発現が口腔癌の顎骨浸潤における役割は極めて重要で、骨浸潤・骨破壊に対する今後の治療に与える影響も非常に大きいと予想される。
現在は、顎骨浸潤部をマイクロCTによる３次元的形態を計測中であり、骨芽細胞、破骨細胞、腫瘍関連マクロファージの病理組織学的検討のための切片を作製中である。腫瘍関連マクロファージの評価は、特異マーカーであるCD163およびCD204の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて、発現部位や顎骨浸潤および腫瘍との位置関係等を解析する予定である。また、詳細な局在性を明らかにするため、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。分化マーカーなどの検討のために、タンパクレベルを免疫組織化学的染色、遺伝子レベルをin situ hybridizationを行い組織学的、微細形態学的、定量力学的に解析し、組織形態の評価を行う予定である。

Causes of Carryover

当初の計画では、平成26年度、顎骨浸潤部をマイクロCTによる３次元的形態を計測し、骨芽細胞、破骨細胞、腫瘍関連マクロファージの病理組織学的検討を行う予定であった。しかし、C3H/HeマウスとCOX-2ノックアウトマウスの双方で顎骨浸潤モデルの作製に時間がかかった。結果、COX-2ノックアウトマウスでは移植性マウス扁平上皮癌細胞（NR-S1細胞株、SCCⅦ細胞株）は生着せず、顎骨浸潤モデルの実験系はC3H/Heマウスで確立した。そのため、マウス扁平上皮癌で、PTHrPmRNA, COX-2mRNAともに発現量が異なるNR-S1細胞株とSCCⅦ細胞株を移植した顎骨浸潤・骨破壊モデルにCOX-2inhibitorを投与し、抗腫瘍効果、顎骨浸潤抑制効果を比較検討した。平成26年度は、in vivoの実験のみに終始し、顎骨浸潤部の３次元的形態計測や病理組織学的検討まで実験が進まなかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

顎骨浸潤部のマイクロCTによる３次元的形態計測後、通法に従い固定、脱灰し、パラフィン包埋あるいは非脱灰標本を作製し、H-E染色による病理組織学的および免疫病理組織学的検討を行う。腫瘍関連マクロファージの評価は、特異マーカーであるCD163およびCD204の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて、発現部位や顎骨浸潤および腫瘍との位置関係等を解析する予定である。また、詳細な局在性を明らかにするため、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。分化マーカーなどの検討のために、タンパクレベルを免疫組織化学的染色、遺伝子レベルをin situ hybridizationを行い組織学的、微細形態学的、定量力学的に解析し、組織形態の評価を行う予定である。