腫瘍関連マクロファージによる口腔癌の顎骨浸潤メカニズムの解明と新たな治療法の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463024
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 里見 貴史 東京医科大学, 医学部, 臨床准教授 (70276921)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 通秀 東京医科大学, 医学部, 助教 (00421066) ; 近津 大地 東京医科大学, 医学部, 教授 (30343122) ; 渡辺 正人 東京医科大学, 医学部, 臨床講師 (40349460) ; 虻川 東嗣 東京医科大学, 医学部, 講師 (50453717) ; 藤川 考 東京医科大学, 医学部, 兼任助教 (60322468) [Withdrawn] ; 長尾 俊孝 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (90276709)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 顎骨浸潤 / 腫瘍関連マクロファージ / 口腔癌

Outline of Annual Research Achievements

顎骨浸潤能の異なる２種類のマウス同系扁平上皮癌細胞（SCCⅦ, NR-S1）における腫瘍関連マクロファージ（Tumor-associated macrophage:TAM）の特に顎骨浸潤部におけるCSF-1/CSF-1Rシグナルによる活性作用に着目し、その局在と役割について検討する。マウス顎骨浸潤モデルに対して、CSF-1R阻害剤を投与しCSF-1/CSF-1Rシグナルを抑制することによる、①TAMおよび前破骨細胞の活性抑制効果、②顎骨浸潤部周囲の過剰血管新生抑制効果、③顎骨浸潤抑制効果、④抗腫瘍効果を解析することを目的にした研究である。
平成26年度は、PTHrP mRNA , COX-2 mRNA発現量の異なる２種類のマウス扁平上皮癌（PTHrP mRNA ：NR-S1細胞株＞SCCⅦ細胞株　約３倍、　COX-2 mRNA：SCCⅦ細胞株＞NR-S1細胞株　約２倍）NR-S1細胞株、SCCⅦ細胞株とも2×107/mlに調整してC3H/Heマウスの右咬筋内に50μl移植して作製したマウス顎骨浸潤モデルを用いて経時的な腫瘍の顎骨浸潤を評価した。①NR-S1群　②NR-S1＋COX-2inhibitor投与群　③SCCⅦ群　④SCCⅦ＋COX-2inhibitor投与群の４群とした。SCCⅦ群で最も顎骨浸潤が著明であった。平成27、28年度は、顎骨浸潤部におけるTAMについて病理組織学的検索を行った。SCCⅦ移植マウス顎骨浸潤モデルを用いて、CSF-1R阻害剤を投与して、顎骨浸潤抑制効果、抗腫瘍効果及びTAMの局在について解析を行った。TAMの評価は、特異マーカーであるF4/80およびCD165の発現を免疫組織化学染色法で解析した。また、CSF-1R(CD155)の発現についても同様に、局在性や顎骨浸潤部および腫瘍細胞との関連性を検討した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究の目的は、口腔癌の顎骨浸潤部における腫瘍関連マクロファージ（TAM）の役割を検討することである。今後、研究を推進する上で、顎骨浸潤部におけるVEGF過剰発現を解析する必要があり、なかでもCOX-2が重要な因子であるため以下の実験を平成26年度に行った。まず、C3H/Heマウス扁平上皮癌（NR-S1細胞株、SCCⅦ細胞株）を移植した顎骨浸潤モデルの実験系を確立し、マウス扁平上皮癌で、PTHrPmRNA, COX-2mRNAの発現量が異なるNR-S1細胞株とSCCⅦ細胞株を移植した顎骨浸潤・骨破壊モデルにCOX-2inhibitorを投与し、抗腫瘍効果、顎骨浸潤抑制効果を比較検討した。SCCⅦ群で最も顎骨浸潤が著明でVEGF過剰発現しており、NR-S1＋COX-2inhibitor投与群で最も緩慢かつVEGF低発現であった。その後、SCCⅦ移植マウス顎骨浸潤モデルを用いて、CSF-1R阻害剤を投与して、顎骨浸潤抑制効果、抗腫瘍効果及びTAMの局在について解析を行った。CSF-1R阻害剤投与群において、明らかな抗腫瘍効果、顎骨浸潤抑制効果は認められていない。TAMの特異マーカーであるF4/80およびCD165の発現やCSF-1R(CD155)の発現を抑制する傾向はあった。良好な結果が得られていないため、CSF-1R阻害剤を投与した顎骨浸潤抑制効果と抗腫瘍効果について再検討（再実験）する予定である。
また、顎骨浸潤部および腫瘍細胞との関連性及び骨芽細胞、破骨細胞、TAMのマーカーについてもreal-time PCRで検討中である。

Strategy for Future Research Activity

CSF-1R阻害剤を投与した顎骨浸潤抑制効果と抗腫瘍効果について再検討（再実験）を行う予定である。腫瘍関連マクロファージ（TAM）の評価は、特異マーカーであるF4/80およびCD165の免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法に問題はない。発現部位や顎骨浸潤および腫瘍との位置関係を、さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いて、詳細な局在性を明らかにする。また、CSF-1R(CD155)の発現についても同様に、局在性や顎骨浸潤部および腫瘍細胞との関連性を検討し、TAMとの関連性について解析する予定である。
また、腫瘍組織より産生されるcyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-6 (IL-6), parathyroid hormone related protein(PTHrP), tumor necrosis factor-a (TNF-a), receptor activator of nuclear factor-κB (RANK), RANKligand (RANKL), osteoprotegerin及び骨芽細胞、破骨細胞、TAMのマーカーのmRNA量についてもreal-time PCRで解析を進めている。

Causes of Carryover

当初の計画では、CSF-1R阻害剤投与群において、明らかな抗腫瘍効果、顎骨浸潤抑制効果が認められるはずであった。良好な結果が得られないまま、TAM発現の解析に進んだことで、さらに研究が行き詰まった。
CSF-1R阻害剤投与群において、抗腫瘍効果まではなくとも、顎骨浸潤抑制効果は認められるはずである。そのため、CSF-1R阻害剤を投与した顎骨浸潤抑制効果と抗腫瘍効果について再検討（再実験）を行う予定である。COX-2 inhibitorを同時投与する実験を計画中である。結果次第で、TAM発現を再解析し、COX-2, IL-6, PTHrP, TNF-a, RANK, RANKL, osteoprotegerin及び骨芽細胞、破骨細胞、TAMのマーカーのmRNA量についてreal-time PCRで解析する予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

CSF-1R阻害剤を投与しTAMおよび前破骨細胞の活性抑制効果、顎骨浸潤部周囲の過剰血管新生抑制効果、顎骨浸潤抑制効果、抗腫瘍効果を解析する予定である。顎骨浸潤マウスは、経時的な腫瘍サイズと体重測定を行い、最終的には屠殺し、顎骨を掃出する。顎骨はマイクロCTによる３次元的形態計測を行った後、H-E染色による病理組織学的および免疫病理組織学的検討を行う。TAMの評価は、F4/80およびCD165の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて、発現部位や顎骨浸潤および腫瘍との位置関係等を解析する予定である。また、詳細な局在性を明らかにするため、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。分化マーカーなどの検討のために、免疫組織化学的染色、in situ hybridizationを行い組織学的、微細形態学的、定量力学的に解析し、組織形態の評価を行う予定である。