2014 Fiscal Year Research-status Report
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26463032
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
吉田 博昭 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (40260624)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻 要 大阪歯科大学, 歯学部, 助教 (80632083)
森田 章介 大阪歯科大学, 歯学部, 教授 (90148461)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 唾液腺 / 転写因子 / 再生医療 / 器官培養 / 唾液腺再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
唾液腺再生の方法には唾液腺幹細胞の分化誘導や転写因子による唾液腺細胞への分化転換などが考えられ，これらの方法を確立するための重要なステップは唾液腺の幹細胞や各構成細胞を分離して解析することである．本研究では，成体マウスから顎下腺を摘出し組織切片と単一上皮細胞標本を作製した．CD117，CD66a，E-cadherin，AQP5，CLDN4，NKCC1およびCK5に対する抗体と蛍光標識２次抗体を用いて染色し，共焦点レーザー顕微鏡で観察した．
結果として，組織切片観察から，CD66aとCD117は主に上皮組織で発現するが，両者の発現パターンは異なることがわかった．CD66aは腺房で強く，また導管では介在部で強く，線条部と排出部では弱かった．CD117は介在部導管で強く，線条部と排出部の一部の細胞で弱く発現し，腺房では発現していなかった．CD66aとCD117は基底細胞や筋上皮細胞では発現していなかった．CD117とNKCC1は介在部，線条部，排出部の導管で発現していた．CD66aとCD117のこのような発現パターンは単一上皮細胞標本でも確認できた．
以上の結果から，唾液腺を構成する腺房，介在部，線条部および排出部導管の各細胞，基底・筋上皮細胞はCD66aとCD117の発現量の違いによって区別できることを示し，これらによって，FACSを用いて各細胞に特異的な遺伝子の同定や幹細胞の濃縮が可能となり，唾液腺再生医療の確立に貢献することが期待される．
本研究成果は，第59回日本口腔外科学会総会と2014th American association of Oral and Maxillofacial surgeons, さらに第26回日本口腔科学会近畿地方会にて“CD117とCD66aにおける唾液腺上皮細胞の分類”のタイトルで発表し，ゴールドリボン賞，優秀ポスター発表賞を受領した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の研究計画により唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要な転写因子の選別・発現を確認した中から，唾液腺形成に必要なものを選別し，マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNA による発現阻害実験を行っている．
(1) マウス胎仔顎下腺の形成過程で発現レベルが上昇する転写因子について，発現データベースの解析を行い，唾液腺上皮組織で発現しているものを選別する.
(2) 上記で選別した転写因子について発現阻害実験および転写因子ネットワーク解析を行い，マウス胎仔顎下腺の成長・形態形成・細胞分化に影響を与える転写因子を選別する.
(3) 上記(2)で選別した転写因子をマウス線維芽細胞に強制発現させ，唾液腺細胞への分化誘導能を持つものを同定し，さらに，唾液腺細胞への分化転換能を持つかどうかを検証する.
形態学的には，概ね予測した器官培養の結果を得られてきているが，実験の手技と行程がきわめて複雑であり，高い成功率での再現性がなかなか獲得できない．
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究計画により唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要な転写因子の選別・発現を確認した転写因子の中から，唾液腺形成に必要なものを選別する．具体的には，マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNA による発現阻害実験を行い，以下のことを調べる．①標的転写因子の発現がsiRNA によって抑制されることを定量PCR によって確認する．②siRNA 処理によって唾液腺の成長および形態形成が抑制されるような転写因子を選別する．③siRNA 処理によって腺房細胞マーカーAQP5，導管細胞マーカーCLDN5，基底細胞マーカーCK14，筋上皮細胞マーカーSMA の発現が抑制されるような転写因子を選別する．マーカー分子の発現は免疫染色および定量PCR によって解析する．
さらに，解析によって選別した転写因子の中から，マウスおよびヒトの唾液腺細胞への分化転換能を持つものを同定するために，以下の研究を計画する．
(1) マウス唾液腺細胞への分化転換能を持つ転写因子の同定
前年度に選別したマウスの転写因子のすべて（ただし，多くても20種類程度）をマウス培養線維芽細胞に発現させて，唾液腺細胞のマーカー分子の発現を免疫染色および定量PCR によって解析する．次に，転写因子を１つずつ除いて同様に解析することにより，唾液腺細胞への分化転換能に必要な転写因子を同定する．さらに，同定した転写因子を１つずつ、および，組み合わせて発現させることによって，唾液腺細胞への分化転換能を持った転写因子セットを同定する．
(2) ヒト唾液腺細胞への分化転換能を持つ転写因子の同定
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| Causes of Carryover |
培養した細胞の形態学的確認はできているが，今後，免疫組織学的分析，ＰＣＲ，などをひかえており，タイミングを合わせて，抗体などを購入する必要があるので，調整が必要であるので．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
培養細胞の形態学的確認の後，免疫組織学的分析，ＰＣＲ，等を進めていく．
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