歯髄処置にて廃棄される神経幹細胞からの神経再生の試み

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463109
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 澤味 規 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特任助教 (90710442)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099) ; 齊藤 一誠 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90404540) ; 野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(大学院), 教授 (50378733) ; 稲田 絵美 鹿児島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助教 (30448568)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 再生歯学 / 神経幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

う蝕が重度に進行し歯髄に達すると、歯髄炎を惹起し、歯髄処置が行われる。これまでは、神経は再生しないと考えられていたが、最近の再生医療研究の発展により、神経幹細胞から神経が再生することが徐々に判ってきた。う蝕に罹患した乳歯歯髄を対象として、今までは廃棄されてきた歯髄内の神経細胞から神経幹細胞が得られれば、これをin vitro で増やし、神経細胞への分化誘導をはかり、自家移植することで機能的な根管充填材として使用するテーラーメイド医療が可能となる。本研究は、このような廃用に帰した歯の有効活用として、廃棄歯髄から神経幹細胞を遺伝子工学的に濃縮する方法を確立し、得られた神経幹細胞の特性解析、in vivo での機能性検定など通じ、当該細胞が歯再生への有効な資材となり得ることを証明することを目的としている。
ヒト乳歯歯髄由来の初代培養細胞への遺伝子導入、それによる遺伝子機能の解析は、その重要性の割にはあまり盛んに行われていない。これまで、当該細胞への効率的遺伝子導入の系が検討されていなかったことが背景にあると思われる。Piggy Bac（PB）トランスポゾンによる遺伝子導入法は、哺乳類細胞でも効率よく外来性の遺伝子導入を達成でき、その結果、当該遺伝子が宿主ゲノムに挿入された遺伝子導入安定株を、通常の系よりも効率良く取得できる。今回、この方法を歯系細胞およびそれに由来するiPS細胞に適用した。その結果、単なるプラスミドだけの導入では安定株が得られなかったものが、PB系のものでは確実に取得することが出来た。PB系を用いた乳歯歯髄細胞およびiPS細胞への遺伝子導入により、遺伝子導入安定株は効率的に取得できる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

乳歯歯髄細胞に関して、これまで知られる神経幹細胞マーカーの発現をRT-PCR 法で検索した。また、廃棄乳歯歯髄を神経細胞培養用培地で培養し、増殖した細胞が神経細胞の特性を示すかを神経細胞のマーカーで検索した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、遺伝子工学的手法による神経幹細胞の単離を行う予定である。神経幹細胞特異的nestin promoterはすでに入手しており、トランスポゾンベクターpT-NEIN [+ EGFP cDNA+ IRES（internal ribosomal entry site）+ neomycin 耐性遺伝子（neo） + ポリA 付加部位]を作製する。遺伝子導入後の乳歯歯髄細胞から、G418にて薬剤耐性細胞を得ることができる。この細胞は神経幹細胞と期待され、神経幹細胞特異的nestin promoter が作動するため、EGFP蛍光を発し、且つ、G418 耐性（neo が発現するので）となる。mRNAレベルでの解析を行い、神経幹細胞マーカーの発現を確認する。

Causes of Carryover

共同研究者に物品を送る際の郵送費として計上予定であったが、タイミングが合わず、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成２７年度内に郵送費として計上予定である。

Research Products

• [Presentation] PiggyBac-transposon-mediated Gene-delivery Efficiently Generates Stable Transfectants From HDDPCs and HDDPC-derived-iPSCs (2015)
  • Author(s): M. SODA, I. SAITOH, E. INADA, T. MURAKAMI, Y. IWASE, N. KUBOTA, T. SAWAMI, Y. MATSUMOTO, Y. YAMASAKI, H. HAYASAKI, H. OHSHIMA, M. SATO
  • Organizer: International Association for Dental Reseach
  • Place of Presentation: John B. Hynes Veterans Memorial Convention Center,Boston, Mass., USA
  • Year and Date: 2015-03-11 – 2015-03-15