口腔細菌による動脈硬化発症における先天性免疫因子gp-340の関与

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463166
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 於保 孝彦 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (50160940)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長田 恵美 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00304816)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔細菌 / 動脈硬化症 / gp-340

Outline of Annual Research Achievements

これまでに動脈硬化病巣から検出されている口腔レンサ球菌の一種であり、申請者らがヒト動脈内皮細胞（HAEC）の炎症を強く誘導することを確認したStreptococcus mutansの各血清型（c, e, f）２株ずつを用いて研究を行った。

１． S. mutans MT8148（c）、S. mutans Xc（c）、S. mutans B14（e）、S. mutans P4（e）、S. mutans MT3940（f）、S. mutans OMZ175（f）をそれぞれHAECとMOI=1で48時間共培養した後、HAECを回収し、gp-340のmRNA発現レベルを調べた。その結果、対照に比してOMZ175は12.2倍、MT3940は5.0倍、B14は3.0倍、P4は2.6倍の発現を示した。ヒトの口腔から最も多く検出されるc型の2株は、いずれも1.2倍程度の低い発現を示した。
２．gp-340のmRNA発現レベルが高かったS. mutans OMZ175を用いて、同様にHAECと共培養した後、HAECを回収し、gp-340のタンパク発現レベルを調べた。抗gp-340抗体を用いた共晶点レーザー顕微鏡観察では、対照に比してS. mutans OMZ175と共培養したHAECは、gp-340の局在を示す蛍光強度がやや強いことが認められた。また、HAECを溶解し、遠心分離によって得た上清を用いて、ドットブロットを行ったところ、対照との差は認められなかった。
３．以上の結果から、S. mutansとの共培養によりHAECにおけるgp-340の発現は、mRNAレベルでは顕著に上昇したが、タンパクレベルでの発現は十分ではないことが認められた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、S. mutansによるHAECからのgp-340の発現誘導を確認し、S. mutansのHAECへの付着・凝集に及ぼすgp-340の作用を検討する予定であった。しかし、最も高いgp-340のｍRNAレベルの発現を誘導したS. mutans OMZ175を用いても、タンパクレベルでの発現は弱く、その機能を調べるに至らなかった。従って、当初計画の達成度は、十分とは言えない。
この点を改善するため、平成26年度は、当初の計画に加えていくつかの実験を行った。まず、HAECの提供者による個体差を考慮して、由来の異なるHAECを用いて同様の研究を行ったが、gp-340のタンパクレベルでの十分な発現を認めることはできなかった。また、HAECを刺激する口腔細菌として、S. mutans以外のグラム陰性常在菌Fusobacterium nucleatumを用いて実験を行った。その結果、HAECに対するF. nucleatumの比率を大きくするにつれてgp-340のmRNA発現レベルは上昇したが、タンパクレベルでの発現は十分ではなかった。この点からグラム陰性細菌のもつLPS等の病原因子は、gp-340の発現誘導には関与しないことが推測された。さらに複数菌の集合体から成る口腔内バイオフィルムを想定し、S. mutansとF. nucleatumの混合刺激も行ったが、結果は同様であった。
これらの理由から、達成度としては半ばであり、使用する血管内皮細胞、刺激に用いる口腔細菌についてさらなる検討が必要である。

Strategy for Future Research Activity

まず、gp-340のタンパクレベルでの発現を十分に認められる系が必要である。平成26年度は、動脈硬化症の発症部位を想定して大動脈血管内皮細胞を用いたが、他の発症部位として心臓の冠状動脈内皮細胞を用いて同様の実験を行う。刺激に用いる口腔細菌は、齲蝕細菌であるStreptococcus mutansとStreptococcus sobrinusをはじめ、他の口腔常在レンサ球菌として、Streptococcus sanguinis、Streptococcus oralis、Streptococcus gordonii等のearly colonizerおよびStreptococcus salivarius、Streptococcus anginosus等を用いる。さらに歯周病細菌も用いる予定である。
これまでの報告で、gp-340タンパクの発現がヒト静脈内皮細胞や末梢の微小血管内皮細胞において認められている。従って、冠状動脈内皮細胞の結果如何ではこれらの細胞を用いることも計画している。末梢の微小血管において発症する閉塞性の動脈硬化症は近年増加傾向にあり、研究対象としては意義がある。
また実験の手技的な面では、微弱なタンパク発現を示すgp-340の検出法についての検討が必要である。現在行っている蛍光抗体を用いた検出法は感度の高い方法であるが、その前処理としての内皮細胞の固定法について検討が要る。また、gp-340は多量の糖を含むタンパクであり、糖鎖を染色・検出する方法など工夫の必要がある。
今後の計画を遂行するにはgp-340タンパクの発現が必須であるため、当面はこの結果を得るための研究を進める。

Causes of Carryover

当初計画で明らかにする予定であった血管内皮細胞におけるgp-340タンパクの発現が、十分に示されなかったことから、その次に予定していたgp-340の機能分析へ進むことができなかった。当該研究に用いる予定の消耗品費を使用しなかったため、次年度使用額を生じることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度は、他種血管内皮細胞を用いてgp-340タンパクの発現を追求する。その後、gp-340の機能分析を進め、この費用を使用する予定である。