気管内吸引による粘膜損傷に栄養状態が及ぼす影響についての基礎的研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463212
• Research Institution: Iwate Prefectural University
• Principal Investigator: 平野 昭彦 岩手県立大学, 看護学部, 准教授 (30305255)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 動物実験 / ウサギ気管 / ELISAkit / ラミニン / フィブロネクチン / コラーゲンⅣ

Outline of Annual Research Achievements

気管組織の基底膜中のⅣ型コラーゲンとラミニンの量，粘膜固有層のファイブロネクチンの量を健常ウサギと低栄養ウサギで比較し差異を検討するため，26年度は気管組織からの蛋白質の抽出方法と使用するELISA キットの妥当性について検討する予備実験を実施した。
最初にウサギ血清を用いて３種類の蛋白質の標識抗体を利用したELISAキットを反応させ定量できるかどうかを検討した。抽出した蛋白質について濃度を何段階かに希釈し、マイクロプレートリーダーを用いて定量測定をした。その結果、ウサギ血清サンプルの濃度に応じて呈色が異なっていることから、蛋白質を測定できることを確認した。使用したELISAキットはウサギの３種類の蛋白質を測定するのに妥当であることを確認した。
次に、健常なウサギの気管組織から蛋白質を抽出し、ELISAを反応させてたんぱく質を測定する方法を検討した。安楽死させたウサギから気管を摘出し、１回目に重量0.5ｇと1ｇの気管を粉砕･凍結処理し，組織から蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質について濃度を何段階かに変えた。３種のELISA キットを用いて処理し，マイクロプレートリーダーを用いて定量分析した．３種類の蛋白質について、0.5ｇと１ｇのいずれの重量の試料でも濃度によって発色の程度が異なっており、測定できていることが確認された。
そこで、２回目は、１回目と同様な方法でウサギ気管を摘出し0.5ｇを２個切り出し、ひとつは１回目と同じ、もうひとつは別の方法で粉砕方法を変えて、ELISAキットを用いて処理した。現在、分析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

健常なウサギを用いた計画した予備実験を実施でき、分析に使用できるELISAキットの確認、分析試料に用いる適切な気管組織の重量、粉砕方法、抽出液の適切な濃度について検討ができた。
栄養状態不良のウサギについては、実験できなかった。その理由は、購入したELISAキットはウサギの蛋白質に作用するかどうかの検討が必要でウサギ血清を用いた計画外の予備実験を行った。使用したELISAキットは外国から輸入するために注文してから納品までに時間を要し、粉砕処理した試料はELISAキットを反応させる前に凍結と解凍を時間をおいて繰り返すことが必要でそれでも時間を要した。共同研究者はそれぞれ教育、研究を持っていて実験の時間を調整する必要もあった。そのために健常なウサギの実験と分析に時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

健常なウサギを用いた実験については方法が検討できたので、栄養不良のウサギでも同じ実験方法で３種類の蛋白質の測定ができるのかを検討し、実験方法を確立する。
次に、健常なウサギと栄養不良ウサギについて確立した実験方法で件数を追加する。