Fluorescent reporter lines in human iPS cells offer useful platforms to study cardiac subtype specification, cell-based therapies of cardiac disease and drug development.

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26501003
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 白吉 安昭 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90249946)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 李 佩俐 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40464292) ; 森川 久未 鳥取大学, 医学部附属病院, 助教 (90707217)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ペースメーカ細胞 / iPS細胞 / イオンチャネル / 可視化 / 心筋分化誘導

Outline of Annual Research Achievements

ヒトiPS/ES細胞を用いた心筋分化誘導系では、各種サブタイプ心筋が混在している。本年度は、これらの混在した心筋細胞集団の中から、それぞれのサブタイプ心筋を純化できる実験系の確立と、純化した各種心筋の解析、およびその再生医療あるいは創薬への応用を目標とした。
具体的には、洞結節ペースメーカ細胞はHCN4イオンチャネルを、そして心室筋細胞はMLC2vミオシン軽鎖を指標に、選択的に分取・純化できるヒトiPS/ES細胞の樹立を試みた。そのために、（１）BACベクターを用いたセミノックイン法によって、HCN4発現を緑色蛍光タンパク質（GFP）で、（２）CRISPR/Cas9によるゲノム編集法によって、MLC2v発現を赤色蛍光タンパク質（mCherry）で、可視化できる二重改変ヒトiPS/ES細胞株の樹立に成功した。
心筋を分化誘導後、FCMで解析すると、GFP陽性細胞が分化誘導後10日前後で、それより遅れ約1ヵ月後にGFP/ｍCherry二重陽性細胞が、続いてｍCherry陽性細胞が観察されることが分かった。これら3種の細胞をセルソーターで分画したところ、予測どおり、GFP陽性細胞は、HCN4を特異的に発現し洞結節ペースメーカ型の電気生理学的特性を、mCherry陽性細胞は、MLC2v陽性の心室筋の特性を示した。また、将来の創薬への応用を目指し、純化したHCN4陽性細胞を用いて、各種イオンチャネルブロッカーに対する応答性を市販心筋細胞と比較検討した。その結果、薬剤として使用される生理学的濃度での反応性を確認することができた。
このように、ヒトiPS/ES細胞の心筋分化誘導系から、生体の洞結節ペースメーカおよび心室筋細胞と同等のサブタイプ心筋を選別採取できる実験系の確立に成功した。これらの細胞解析は、途上であるが、創薬への展開などに有望であると考えている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] コロンビア大(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: コロンビア大
• [Journal Article] 1.Molecular mechanisms underlying the pilsicainide-induced stabilization of hERG proteins in transfected mammalian cells. (2018)
  • Author(s): Takeshi Onohara, Ichiro Hisatome, Yasutaka Kurata, Peili Li, Tomomi Notsu, Kumi Morikawa, Naoyuki Otani, Akio Yoshida, Kazuhiko Iitsuka, Masaru Kato, Junichiro Miake, Haruaki Ninomiya, Katsumi Higaki, Yasuaki Shirayoshi, Takashi Nishihara, Toshiyuki Itoh, Yoshinobu Nakamura, Motonobu Nishimura.
  • Journal Title: Journal of Arrhythmia Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.joa.2016.09.003
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] M3 Muscarinic Receptor Signaling Stabilizes a Novel Mutant Human Ether-a-Go-Go-Related Gene Channel Protein via Phosphorylation of Heat Shock Factor 1 in Transfected Cells. (2016)
  • Author(s): Mahati E, Li P, Kurata Y, Maharani N, Ikeda N, Sakata S, Ogura K, Miake J, Aiba T, Shimizu W, Nakasone N, Ninomiya H, Higaki K, Yamamoto K, Nakai A, Shirayoshi Y, Hisatome I.
  • Journal Title: Circ J. Volume: 80 Pages: 2443-2452
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-16-0712
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of the novel mutant A78T-HERG from a long QT syndrome type 2 patient: Instability of the mutant protein and stabilization by heat shock factor 1. (2016)
  • Author(s): Kondo T, Hisatome I, Yoshimura S, Mahati E, Notsu T, Li P, Iitsuka K, Kato M, Ogura K, Miake J, Aiba T, Shimizu W, Kurata Y, Sakata S, Nakasone N, Ninomiya H, Nakai A, Higaki K, Kawata Y, Shirayoshi Y, Yoshida A, Yamamoto K.
  • Journal Title: J Arrhythm. 2016 Oct;32(5):433-440. Volume: 32 Pages: 433-440
  • DOI: 10.1016/j.joa.2015.10.005
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prion Protein and Stage Specific Embryo Antigen 1 as Selection Markers to Enrich the Fraction of Murine Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. (2016)
  • Author(s): Ikeda N, Nakayama Y, Nakazawa N, Yoshida A, Ninomiya H, Shirayoshi Y.
  • Journal Title: Yonago Acta Med. Volume: 59 Pages: 126-134
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Fluorescent human iPS reporter lines offer useful platforms to study cardiac subtype specification and cell-based therapies of cardiac disease. (2017)
  • Author(s): Yasuaki Shirayoshi, Kenta Fukumura, Kumi Morikawa, Ichiro Hisatome
  • Organizer: ISSCR 2017
  • Place of Presentation: Boston, USA
  • Year and Date: 2017-06-14 – 2017-06-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fluorescent Human iPS/ES Reporter Lines Offer the Opportunity to Track Cardiac Subtype Cells in Cell-based Therapies and Drug Development (2017)
  • Author(s): Yasuaki Shirayoshi, Kumi Morikawa, Kenta Fukumura, Ichiro Hisatome
  • Organizer: 第81回 日本循環器学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂他、金沢
  • Year and Date: 2017-03-17 – 2017-03-19
• [Presentation] 虚血性心不全モデルに対する脂肪幹細胞シートと心不全薬の併用効果の検討 (2017)
  • Author(s): 山本堅士郎、丹野翔伍、足立真彩、森川久未、大月優樹、大谷直由、陶山淑子、八木俊路朗、荻野和秀、三明淳一朗、白吉安昭、山本一博、西村元延、久留一郎
  • Organizer: 第16回 日本再生医療学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター、仙台
  • Year and Date: 2017-03-07 – 2017-03-09
• [Presentation] ヒトiPS細胞に由来するHCN4陽性心筋前駆細胞の解析 (2016)
  • Author(s): 福村健太、横井文香、森川久未、野崎大蔵、久留一郎、白吉安昭
  • Organizer: 第39回 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、横浜
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 選別純化したヒト多能性幹細胞由来分化誘導心筋に関する電気生理学的特性と薬剤応答性の評価 (2016)
  • Author(s): 白吉安昭、森川久未、山内香織、横井文香、福村健太、野崎大蔵、末盛博文、久留一郎
  • Organizer: 第43回 日本毒性学会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、名古屋
  • Year and Date: 2016-06-29 – 2016-07-02
• [Remarks] 鳥取大学大学院 医学系研究科 機能再生医科学専攻 遺伝子再生医療学講座 再生医療学
  • URL: http://www.tottori-u.ac.jp/remed/
• [Remarks] 生物学的ペースメーカの作製とその応用
  • URL: http://www.tottori-u.ac.jp/introduction/grad/297/430/563/1345.html