2014 Fiscal Year Research-status Report

上皮間葉転換(EMT)による幹細胞誘導リプログラミングの分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number	26501006
Research Institution	Teikyo University of Science & Technology
Principal Investigator	真先敏弘帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (00585028)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	斉藤史明帝京大学, 医学部, 准教授 (40286993) 松村喜一郎帝京大学, 医学部, 教授 (50260922) 萩原宏毅帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (80276732)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	幹細胞 / シュワン細胞 / 上皮間葉転換 / リプログラミング / 間葉系幹細胞 / 国際情報交換（英国）
Outline of Annual Research Achievements	１）　IMS32（マウス不死化シュワン細胞、東京都医学総合研究所、渡部和彦先生より供与）をTGF-bで刺激すると線維芽細胞様の形態に変化し、上皮間葉転換が起こったと考えられた。これらの細胞を幹細胞培地で培養したところ、一部にcontrolより大きなsphereが形成されたが、それらのsphereはcontrolと同様、培養４８時間後より急速に減少した。Jagged-1によるNotch信号系刺激やWnt信号系刺激では、細胞形態の変化やsphere形成効率の明らかな上昇は見られなかった。Jagged-1刺激ではsphere生存期間の軽度の延長が見られたが、間葉系幹細胞に見られるような長期間（数か月程度）の生存は見られなかった。２）　IMS32およびRT4（ラットシュワノーマ細胞）にレンチウイルスを用いてSnai1遺伝子を導入した上でピューロマイシンで選択することにより、これら２種の細胞株において100%GFP陽性（Snai1陽性）の細胞株を得ることができた。これらのSnai1導入に伴う明らかな細胞形態変化やsphere形成効率の亢進は見られなかったが、Snai1導入IMS32をさらにTGF-bで刺激したところ、１）と同様に線維芽細胞様の形態に変化（上皮間葉転換の誘導）するとともに著明な増殖速度の亢進を認め、未熟な間葉系細胞が誘導された可能性が考えられた。今後はこの細胞を出発点として間葉系幹細胞誘導を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason １）　IMS32をTGF-b刺激すると上皮間葉転換が起こり、間葉系細胞が誘導されたこと。２）　IMS32にSnai１遺伝子を導入した上でTGF-b刺激すると１）と同様に上皮間葉転換が起こったが、誘導された間葉系細胞の増殖速度は１）で誘導された細胞に比べはるかに速かったこと。以上の結果は、ハンセン病原因菌によりシュワン細胞から上皮間葉転換を介して誘導された間葉系幹細胞の増殖速度が非常に速かった事実と考え合わせると、Snai1強制発現とTGF-b刺激の組み合わせにより未熟な間葉系細胞の誘導に成功したことが強く示唆される。しかしこの未熟な間葉系細胞が間葉系幹細胞と言える段階までリプログラムされているかどうかの確認、特にsphere形成能についての詳細な評価が未施行であることから、１年間で間葉系幹細胞を誘導するという当初の計画よりは「やや遅れが見られる」と自己評価する。
Strategy for Future Research Activity	１）　Snai1強制発現+TGF-b刺激により得られた未熟間葉系細胞のsphere形成効率や生存期間を解析する。この結果が間葉系幹細胞の誘導を支持するに十分なものであれば、次の段階として間葉由来細胞（骨、軟骨、脂肪）への分化能力、移動能力、アポトーシス耐性能力、エピジェネティック修飾の状態などを検索していく。２）　この細胞のsphere形成効率が不十分な場合は上皮間葉転換促進・阻害因子の解析を行う：　IMS32においてSnai1遺伝子導入前後における上皮間葉転換マスター転写因子(Snai, Twist, Zebなど)、microRNA(miR-200)などの発現をmicroarrayなどを用いて分析する。上皮間葉転換関連信号伝達系(TGF-b, Notch, Wntなど)についても蛋白リン酸化解析などにより活性化の有無を分析する。これらの結果を踏まえながら、より効率的な幹細胞誘導法の開発を目指す。
Causes of Carryover	物品が一部予想より安く購入できたため
Expenditure Plan for Carryover Budget	他物品の購入に使用する