2014 Fiscal Year Research-status Report
FFPE臨床試料のプロテオーム解析プラットフォームの構築
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26505005
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
若林 真樹 京都大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (70552024)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | プロテオミクス / リン酸化プロテオミクス / FFPE / 高感度分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
FFPE試料の回収方法に関して検討を行った。これまでに我々は、抗体染色などの手法でFFPE試料を解析する際と同様に、脱パラフィン、エタノール/水系を用いた加水を行った後、相間移動可溶化剤（PTS）によるタンパク質抽出を行うことで高効率にタンパク質を回収可能であることを示してきた。しかしながら、プロテオーム解析に際して脱パラフィンや加水といった工程は必須ではないと考え、煩雑な作業工程による前処理時間の増加や試料のロスを省き、簡便かつ高効率な前処理手法を確立するために、各ステップの省略を試みた。キシレンによる脱パラフィン後、エタノール/水系での加水を行う代わりにタンパク質抽出液としてPTS溶液を直接添加することでタンパク質を回収し、プロテオーム解析を行った結果、従来法と同等もしくはそれ以上のタンパク質同定数を得ることが可能であった。さらに、脱パラフィン作業をも省略し、PTS溶液を直接添加することで、タンパク質抽出と脱パラフィンを同時に完了することが可能であった。脱パラフィンの省略によるタンパク質抽出効率や消化効率への悪影響なども観察されず、タンパク質同定数も従来法と同等であった。従来法のタンパク質回収率が非常に高いため、タンパク質同定数に大きな改善は見られなかったが、ほぼすべての前処理過程を省略することで、スループットの大幅な改善を達成した。次に、HE（ヘマトキシリン・エオジン）染色試料に関する検討を行った。ヘマトキシリン、エオジンにより染色を行った組織からのタンパク質回収量は、未処理の組織と比べて50-80%程度であった。これらの試料に対して上述した試料回収法を用いて脱色とタンパク質回収を同時に完了することで回収率の向上を試みたが、大きな改善は見られなかった。これらのタンパク質量の損失が生じる過程と損失を受けるタンパク質群にに関して詳細な解析を進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
汎用性が高く、高効率かつ簡便なFFPE試料の前処理手法を確立することができた。HE染色試料に関しては、前処理手法の改善が必要かどうか、試料の特性をより詳細に調べる必要がある。引き続き試料に関する検討を行うとともに、測定手法の改善により、より高感度かつ汎用的な解析プラットフォームの構築を目指す予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
HE染色試料からのタンパク質回収量が低いという問題に対し、タンパク質の損失が染色過程で生じているものか、回収過程で生じているものか検討を行う。試料の前処理に関する考察が完了し次第、マイクロダイセクションなどにより採取した組織などの極微量試料に対して確立した手法を適用する。さらに、キャピラリー内で酵素消化や脱塩等の前処理を行い、直接LC－MSへと接続する手法を確立することで試料ロスの最小化を試みる。また、内径の小さなメートル長モノリス型カラムを用いた高分離かつ高感度な分析系を確立し、組み合わせることでFFPE試料の超高感度分析系を確立する。
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| Causes of Carryover |
本年度は手法の確立に終始したため、臨床試料などのFFPE実試料の購入を行わなかった。また、これに伴って、定量のために必須となる安定同位体試薬や、LC-MSに関連する消耗品などの購入の必要がなかったことにより、物品購入等による使用額が予定より大幅に少なくなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、確立した手法を用いた実試料の解析へと進展させる予定であり、実臨床試料の購入や、LC-MS用消耗品、定量用安定同位体試薬など、高額なものが多数必要となる。
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