2015 Fiscal Year Research-status Report
白血病細胞耐性機構のリバースグライコミクス的解明と抗癌剤耐性診断法の開発
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26505008
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
中の 三弥子 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (40397724)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 糖鎖分析 / 白血病 / 薬剤耐性 / グライコミクス / 診断法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
白血病細胞などの癌細胞も含めて真核細胞の表面はタンパク質や脂質から伸びた糖鎖で覆われている。その糖鎖は、受精、分化、癌化や免疫など生命現象に直結した多くの機能に関与していることがわかってきている。糖鎖は遺伝子から出来た様々な種類の糖転移酵素と糖分解酵素が協奏的に働くことにより様々な種類の構造が生成する。疾患により生体内状況が変化すると、これらの酵素群の協奏的作業が変化し糖鎖構造が変わる。そのため疾患を知るには、遺伝子側からではなく、その結果産物である糖鎖側から、つまりリバースグライコミクス的に研究を進めていく方が良いと考え実験を進めている。初めの1年間（26年度）は、急性リンパ性白血病細胞株の1種（CEM細胞株）が抗癌剤（デオキシエポチロンB）の耐性を獲得するとα2-6シアリル化糖鎖が減少することを見出し、その機序と、耐性獲得との因果関係を調べた。シアル酸関連の糖転移酵素(ST6Gal1, ST3Gal3, ST3Gal4など)と糖分解酵素(シアリダーゼNeu1～Neu4など)および薬剤耐性因子（MDR1,MRP1など）のmRNAの発現量を測定した結果、ST6Gal1のmRANだけが減少していることがわかった。CEM細胞株のST6Gal1を遺伝子工学的にノックダウンおよび強制発現したり、さらには、α2-6シアル酸を発現していないチャイニーズハムスター卵巣細をモデル細胞として用いることで、糖鎖構造と耐性獲得との因果関係を明らかにした。2年目（27年度）は、急性リンパ性白血病だけでなく、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病の細胞株においても、同じ糖鎖変化が起きるかを調べる予定であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の2年目（27年度）の計画では、4種の白血病細胞株（急性リンパ性白血病細胞株、慢性リンパ性白血病細胞株、急性骨髄性白血病細胞株、慢性骨髄性白血病株、）の3種の微小管作用抗癌剤（デオキシエポチロンB、ビンクリスチン、パクリタキセル）に耐性を獲得した細胞株を作製し、糖鎖構造解析、糖鎖構造変化の機序解明、および耐性獲得との因果関係を調べる予定であったが、特に慢性リンパ性白血病細胞株、急性骨髄性白血病細胞株、慢性骨髄性白血病株において、耐性株が樹立できなかった。また、急性リンパ性白血病細胞株の3種のCEM細胞株、Jurkat細胞株、Ball-1細胞株においても、ビンクリスチンの耐性株した樹立できなかった。また、そのビンクリスチン耐性株においても糖鎖構造に劇的な変化は示さなかった。有意差のあるシアル酸の減少は観察されたが、1年目のデオキシエポチロンB の耐性CEM細胞株の1/2程度のシアル酸変化であった。よって樹立法を見直す必要がある。耐性を獲得していない細胞が混ざっていることが原因である。これまではバッチ法（多くの細胞数で処理する方法）で耐性を獲得させた細胞を作製していたが、現在、無限希釈法（１つの細胞から始める方法）で時間をかけて耐性獲得細胞を作製している。作製している細胞株は、3種の急性リンパ性白血病細胞株（CEM細胞株、Jurkat細胞株、Ball-1細胞株）の2種の微小管作用抗癌剤（ビンクリスチン、パクリタキセル）の耐性株である。これら6種の耐性株が出来次第、初めに、細胞膜の糖鎖構造解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画で、最終年度（28年度）では、汎用性の高い白血病の抗癌剤耐性獲得診断法の開発を行う予定だったが、それは、この年度の最後に行う。まずは、3種の急性リンパ性白血病細胞株（CEM細胞株、Jurkat細胞株、Ball-1細胞株）の2種の微小管作用抗癌剤（ビンクリスチン、パクリタキセル）の耐性株の樹立である。樹立後、順に以下の実験を行う。1.耐性株の細胞膜上の糖鎖の構造解析。2.シアル酸関連の糖転移酵素（ST6Gal1, ST3Gal3, ST3Gal4）と糖分解酵素（Neu1～4）のmRANのqRT-PCRによる測定を行う。3. 細胞株に遺伝子工学的にST6Gal1を導入またはノックダウンさせ、糖鎖構造に反映されたかを確認後、耐性試験を行い、糖鎖変化と耐性獲得の因果関係を明らかにする。4. 蛍光小分子を用い細胞の取込能と排出能の測定を行う。5. 既知の薬剤耐性因子（MDR1、MRP1、RPN2など）のmRANのqRT-PCRによる測定を行う。今年度の最後に、1～5の結果を基に、耐性獲得マーカーの簡便測定法の開発を行う。細胞株でなく、白血病患者および抗癌剤耐性白血病患者の血液中の白血病細胞を使って検討したかったが、それらを提供して頂くことが困難になったため、2年目より様々な白血病細胞株に切り替えて検討している。しかし、最後の実験である耐性獲得マーカーの簡便測定法の開発においては、血液から測定できることに意義がある。したがって、本研究では健常者血液に、白血病細胞株および作製した耐性細胞株を混ぜて、リンパ球を濃縮後、レクチンで糖鎖の変化を定量できるかを調べることとする。
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| Causes of Carryover |
効率的に経費を使用し、当初予定の使用額を下回ったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に購入予定であった機器分析用消耗品を平成28年度に購入するため。
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