2016 Fiscal Year Research-status Report
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26506012
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
長沼 毅 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (70263738)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Dアミノ酸 / 定量PCR / ラセマーゼ / Dアミノ酸脱水素酵素 / Dアミノ酸酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
3年度目は、Dアミノ酸の資化能、すなわちDアミノ酸を栄養源として生育する能力が異なる4株（種類は3種類）の微生物を用いて、Dアミノ酸代謝に関連する4種類の酵素の遺伝子発現を定量した。
用いた微生物はわれわれが環境から得た単離株（Dアミノ酸でよりよく生育する微生物）とそれが所属する種（Raoultella ornithinolytica）の標準株（理研JCM 6096）ならびに他のDアミノ酸資化菌株（緑膿菌Pseudomonas aeruginosa JCM 5962株および大腸菌Escherichia coli W3110株）の4株である。
対象とした遺伝子はアミノ酸ラセマーゼ、Dアミノ酸脱水素酵素（DAD）、Dアミノ酸酸化酵素（DAO）およびDアミノ酸を細胞壁の構成成分にする酵素（murD/F）の4種類とした。また、それらの遺伝子の定量はリアルタイム逆転写定量PCR（RT-RT-qPCR）による比較Ct法（⊿⊿Ct法）を用いて行った。
この定量の結果、「成長曲線」における特定の成長段階でDアミノ酸脱水素酵素（DAD）がより多く発現していることがわかった。
この結果を得るまでは、「Lアミノ酸とDアミノ酸を可逆的に変換するラセマーゼ」がいちばんよく使われると予想していた。しかし、本研究で得られた結果は予想を覆すものだった。すなわち、単離株、R. ornithinolytica、P. aeruginosaの3株ではラセマーゼよりむしろDアミノ酸脱水素酵素（DAD）の遺伝子発現が顕著であったことは驚きであった。この理由としては、おそらく、Dアミノ酸資化には、電子受容体の種類が多く、よりマイルドな状態で、ワンステップでα-ケト酸を生じるDADがまず使われやすいということが考えられる。ただし、DADの発現量が増すタイミングは菌株ごとに異なっていた。この点は今後、詳細に解明すべき課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度には環境から単離・純粋培養した「Dアミノ酸でよりよく生育する微生物」について、生理生化学的および系統分類学的なキャラクタリゼーションを行った。
2年度目にはその単離株について、Dアミノ酸代謝に関連する酵素の遺伝子発現の定量を行ったが、それはまだ実験系の確立を目指した予備的なものであった。
3年度目となるH28年度は、単離株とそれが所属する種（Raoultella ornithinolytica）の標準株（理研JCM 6096）ならびに他のDアミノ酸資化菌株（緑膿菌Pseudomonas aeruginosa JCM 5962株および大腸菌Escherichia coli W3110株）を用いて、Dアミノ酸代謝に関連する酵素の遺伝子発現の定量を行い、結果を比較することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
3年度目の結果を得るまでは、「Lアミノ酸とDアミノ酸を可逆的に変換するラセマーゼ」がいちばんよく使われると予想していた。しかし、3年度目に得られた結果は予想を覆すものだった。すなわち、単離株、R. ornithinolytica、緑膿菌の3株ではラセマーゼよりむしろDアミノ酸脱水素酵素（DAD）の遺伝子発現が顕著であった。ただし、その発現量が増すタイミングは菌株ごとに異なっていたので、4年度目（最終年度）にはそれを詳細に調べる予定である。
また、大腸菌E. coli W3110でもラセマーゼよりmurF（Dアラニンを細胞壁に取り込む酵素）の遺伝子発現のほうが大きかった。この酵素が触媒する反応はATPを消費するので、クエン酸回路のようなエネルギー生産系ではなく、エネルギー消費系である。大腸菌E. coli W3110にとって、Dアラニンしかエネルギー源および炭素源しかない状況で、エネルギー消費してまで細胞壁合成関連の遺伝子発現をすることにどういうメリットがあるのか、現時点では予想すらできないが、4年度目にはそれを考察できるだけのデータを得ることを期す。
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| Causes of Carryover |
定量PCRの実験系の確立に予想外の時間が掛かり、当初予定していた実験を年度内に円滑に行うのが難しく、安全を期して準備に時間を掛けることにしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
定量PCRの実験系が確立できたので、引き続き残りの定量PCR実験を行うとともに、これまでの定量PCRから見えてきた新たな課題についての補足的な実験を行うこととする。
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