2017 Fiscal Year Research-status Report
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26506012
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
長沼 毅 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (70263738)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Dアミノ酸 / Raoultella / R. ornithinolytica / Pseudomonas aeruginosa / Dアミノ酸脱水素酵素 / Dグルタミン酸 / 遺伝子発現 / 定量PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
4年度目も前年度同様、D網の酸を唯一の炭素源として生育できる3株（種類は2種類）の微生物を用いて、Dアミノ酸代謝に関連する4種類の酵素、すなわちDアミノ酸脱水素酵素 (DAD)、グルタミン酸ラセマーゼ、Dグルタミン酸酸化酵素およびDアミノ酸を細胞壁の構成成分にするUDP-N-アセチル-α-D-ムラモイル-L-アラニル-Dグルタミン酸リガーゼの遺伝子（順にdadA、murI、daoおよびMurD）の発現量を、リアルタイム逆転写定量PCRの比較Ct法（⊿⊿Ct法）により測定した。
用いた微生物は環境単離株「A25」（Dアミノ酸でよりよく生育する微生物）とその帰属種（Raoultella ornithinolytica）の標準株（理研JCM 6096）ならびに他種で代表的なDアミノ酸資化菌株（緑膿菌Pseudomonas aeruginosa JCM 5962株）の3株である。
これら3株について、Dグルタミン酸を唯一の有機栄養基質（炭素源）として培養した場合、Dアミノ酸脱水素酵素（DAD）の遺伝子（dadA）が最も顕著に発現していることが再確認された。この結果は、「Lアミノ酸とDアミノ酸を可逆的に変換するラセマーゼの遺伝子が最も顕著に発現する」という当初の予想を覆すものだった。すなわち、ラセマーゼよりDアミノ酸脱水素酵素（DAD）の、しかも、Dグルタミン酸酸化酵素（DAO）ではなくDADの遺伝子発現が顕著であったことは驚きであった。
この理由として、Dグルタミン酸だけで生育するには、Dアミノ酸からワンステップでα-ケト酸を生じるDADが使われやすいだろうこと、そして、DAOでは使える酸化剤（電子受容体）の種類が少ない上に過酸化水素が生じるのに対し、DADは使える電子受容体の種類が多い上に過酸化水素を生じないマイルドな状態で反応が進むことが利点であるためと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度には環境から単離・純粋培養した「Dアミノ酸でよりよく生育する微生物」（A25株）について、生理生化学的および系統分類学的なキャラクタリゼーションを行った。
2年度目にはその単離株（A25）について、Dアミノ酸代謝に関連する酵素の遺伝子発現の定量を行ったが、それはまだ実験系の確立を目指した予備的なものであった。
3年度目には、単離株（A25）とそれが所属する種（Raoultella ornithinolytica）の標準株（理研JCM 6096）ならびに他のDアミノ酸資化菌株（緑膿菌Pseudomonas aeruginosa JCM 5962株および大腸菌Escherichia coli W3110株）を用いて、Dアミノ酸代謝に関連する酵素の遺伝子発現の定量を行い、結果を比較した。
4年度目となる平成29年度には、A25株とR. ornithinolyticaおよびP. aeruginosaの3株について追試験を行なって前年度の結果を再確認し、かつ、3株間で遺伝子発現のタイミングを比較することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
3年度目の結果を4年度目で追認するまでは、「Lアミノ酸とDアミノ酸を可逆的に変換するラセマーゼ」がいちばんよく使われると予想していた。しかし、4年度目に追認された結果は当初の予想を覆すものだった。すなわち、単離株、R. ornithinolytica、緑膿菌の3株ではラセマーゼよりむしろDアミノ酸脱水素酵素（DAD）の遺伝子発現が顕著であった。ただし、その発現量が増すタイミングは菌株ごとに異なっていた、すなわち、A25株とR. ornithinolyticaでは対数増殖期の初期にDADが最も顕著に発現したのに対し、P. aeruginosaでは定常期の後期に最も顕著に発現した。この点は今後、詳細に解明すべき課題である。ので、5年度目（最終年度）にはそれを詳細に調べる予定である。
また、大腸菌E. coli W3110でもラセマーゼより「Dアラニンを細胞壁に取り込む酵素」の遺伝子（murF）のほうがよく発現するという結果が得られているが、その結果を説明することにはまだ成功していない。すなわち、この酵素が触媒する反応はエネルギー生産系ではなくATP消費系であるにもかかわらず、大腸菌E. coli W3110にとって、Dアラニンしかエネルギー源および炭素源しかない状況で、エネルギー消費してまで細胞壁合成関連の遺伝子発現をすることにどういうメリットがあるのか、現時点では説明できないのである。5年度目にはそれを考察できるだけのデータを得ることを期す。
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| Causes of Carryover |
理由：定量PCRの実験系の確立に予想外の時間が掛かり、当初予定していた実験を年度内に円滑に行うのが難しく、安全を期して準備に時間を掛けることにしたため。
使用計画：定量PCRの実験系が確立できたので、引き続き残りの定量PCR実験を行うとともに、これまでの定量PCRから見えてきた新たな課題についての補足的な実験を行うこととする。
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