2014 Fiscal Year Research-status Report
DNAポリメラーゼによる新規変異誘発機構に関する研究
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26550034
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| Research Institution | Japan Atomic Energy Agency |
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Principal Investigator |
鹿園 直哉 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 量子ビーム応用研究センター, 研究主幹 (10354961)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 突然変異誘発機構 / DNA基質 / クラスターDNA損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、クラスターDNA損傷に対する変異誘発機構の解明を通じ新たな変異誘発機構の手がかりを得ることを目的としている。化学合成したDNA損傷を組み合わせて構成した人工クラスターDNA損傷が環状のプラスミド上に配置されたDNA基質は、クラスターDNA損傷の変異誘発機構を分子遺伝学的に調べるために大変適したものである。これまでプラスミドに人工クラスターDNA損傷を配置させる手法として主に用いられてきたのは、人工クラスターDNA損傷が配置されたオリゴヌクレオチドと制限酵素で切断されたプラスミドをライゲーションするというものであった。しかし、この手法では多量体や末端にオリゴヌクレオチドが連結した線状のプラスミドといった目的とする環状のプラスミド以外のものも作製されてしまうという課題があった。そこで本年度は、クラスターDNA損傷を有する環状プラスミド基質を作製する手法に関して研究を進めた。
環状プラスミドの作製には、（１）ウラシルを含む１本鎖DNAを鋳型としてDNA損傷が入ったオリゴヌクレオチドをプライマーとしてDNA合成を行い、（２）DNA損傷を含む1本鎖の環状DNA鎖を合成し、（３）その後ウラシルを含む鋳型鎖を、ウラシルDNAグリコシラーゼ、エキソヌクレアーゼで消化後、（４）再びDNA損傷をもつオリゴヌクレオチドをプライマーとしてDNA損傷を含む1本鎖の環状DNA鎖を鋳型としてDNAを合成し、（５）目的の環状プラスミドを精製する、というステップが必要である。今年度は各ステップで条件設定を行い、上記手順により環状プラスミドが合成できること、及び、合成されたプラスミドには損傷が導入されていることを確かめた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度中には分子遺伝学的なアプローチによる変異誘発機構に関する実験に着手の予定であったが、基質DNAの作製のための条件設定に少し時間がかかった。当初の計画より若干遅れている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は作製したクラスターDNA損傷を含む環状プラスミドDNAを基質として用い、分子遺伝学的手法を用いて、クラスターDNA損傷を含む分子の複製過程を解析する予定である。具体的には、細胞への形質転換を行って突然変異誘発頻度を測定するとともに、プラスミドの複製が両鎖からほぼ均等に行われているかどうかを調べる実験を進める。
また生化学的な側面からクラスターDNA損傷の変異誘発機構を明らかにする実験にも着手する。試験管内でクラスターDNA損傷を含むDNA分子を用い、精製されたDNAポリメラーゼによる鋳型乗り換え活性の検出を試みる。
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| Causes of Carryover |
実験の条件設定に時間がかかり、当初の計画より研究の進捗状況がやや遅れ気味となったため、想定より少ない使用額となり次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
分子遺伝学的な研究を進めるために必要な準備は整い、次年度以降は研究が大いに進むと考えている。今年度未使用分は、DNA基質の細胞内への導入や鋳型傷乗り越え活性の検出系の確立等の実験で余らすことなく使用する予定である。
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