2015 Fiscal Year Annual Research Report
エピジェネティックな転写抑制を促進させる化学物質検出系の確立
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26550041
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
八木 孝司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80182301)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川西 優喜 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70332963)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | エピミュータジェン / エピジェネティックス / バイオアッセイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．HeLa S3細胞にX線を１.5グレイ照射し、２週間培養後、10 cm dishに105個播種し、30μM 6-thioguanineまたは100μg/ml ganciclovirを含む培地で選択し、生じたコロニーを10個ずつ単離した。これらクローン化された細胞をRT-PCR法によってhprtまたはtk遺伝子が発現していないことを確認した細胞を、それぞれHeLaHprt2、HeLaTK5細胞と名付けた。
２．MGMTプロモーター(メチル化のターゲットとなるCpGアイランドを含む)の下流にHSV-tk遺伝子またはhprt cDNAを連結してプラスミドpSV3neoに挿入した。それぞれをpSV２neoMGMTtk、pSV２neoMGMThprtと名付けた。pSV２neoMGMTtkをHeLaHprt2細胞、pSV２neoMGMThprtをHeLaTK5細胞に導入し、共に400μg/mL G418を含む培地で選択した。それぞれ10コロニーずつ単離し増殖させた。これらクローン細胞を再度30μM 6-thioguanineまたは100μg/ml ganciclovirを含む培地で培養し、増殖しないことを確かめた。これらの細胞のうちRT-PCR法によってhprtまたはtk遺伝子が発現していることを確認できた細胞をHeLaEMhprt1、HeLaEMtk2細胞と名付け、以後の実験に用いることにした。
3. 現在HeLaEMhprt1、HeLaEMtk2細胞のMGMTプロモーターの低メチル化をHeLaMR細胞（MGMTプロモーターがメチル化している）との比較を通してbisulfite sequencingによって確認すると共に、ヒストンアセチル化酵素阻害剤garcinol、ヒストンメチル化酵素阻害剤ChaetocinでHeLaEMhprt1およびHeLaEMtk2細胞のそれぞれ30μM 6-thioguanine、100μg/ml ganciclovir耐性クローンの出現頻度を測定している。
４．一方でHeLaMR細胞を用いたMGMTプロモーター脱メチル化系を用いて、三酸化ニ砒素（As2O3）の脱メチル化活性を確かめた。
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