2015 Fiscal Year Research-status Report
多様な動物種に適用できる内因性ホルモンの高精度分析法の開発
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26550048
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
国末 達也 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 教授 (90380287)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 甲状腺ホルモン / ステロイドホルモン / 機器分析 / タンパク結合型 / 遊離型 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、甲状腺ホルモン（THs）の恒常性機能を評価する上で、より重要度の高い生理学的活性を有する遊離型THs(タンパク非結合型）の分析法（限外ろ過法）開発を試みた。定性・定量には、昨年度確立した高速液体クロマトグラフタンデム質量分析計(LC-MS/MS)のエレクトロスプレーイオン化法のポジティブモードを用いた。ウシ血清を検討試料とし、プロホルモンとして作用するL-thyroxine (T4)および核内受容体(thyroid hormone receptor: TR)に対し活性化を有する3,3’,5-triiodo-L-thyronine (T3)だけでなく、3,3’,5’-triiodo-L-thyronine (rT3)も対象物質とした。遊離型THsの場合、タンパク結合型との分離が不可欠となる。血中輸送タンパクであるthyroxine-binding globulin (TBG)、transthyretin (TTR)、そしてalbuminが54-66kDaの範囲内にあるため、30kDa以下の分離フィルターを有する3種のultrafiltrationデバイス（Centrifree YM-30、Amicon Ultra-0.5、Nanosep Omega）を用いて検討をおこなった。測定値に影響を及ぼすと考えられるpHや温度設定、そして遠心力・時間について綿密な精度チェックを実施した結果、最も良好な値を示したCentrifree YM-30を本手法の限外ろ過デバイスとして選定した。ウシ血清からは遊離型のrT3が検出されなかったため、T4とT3の日内および日間変動を確認したところ12%以下と良好な値が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、甲状腺ホルモン（THs）恒常性機能の評価にきわめて重要な生理学的活性を有する遊離型THs(タンパク非結合型）について、限外ろ過法を用いた分析法を確立した。30kDa以下の分離（血中輸送タンパクとの分離）フィルターを有する3種のultrafiltrationデバイス、(1)先行研究でヒト血清中遊離型THs分析に使用されたCentrifree YM-30、(2)YM-30と同様の膜素材(再生セルロース)を有するAmicon Ultra-0.5、(3)安価で血清中遊離型医薬品分析で実績のあるNanosep Omegaを用いて検討をおこなった。ウシ血清を検討試料とし、L-thyroxine (T4)と 3,3’,5-triiodo-L-thyronine (T3)の定量は、昨年度確立したLC-MS/MS測定法を用いた。その結果、Centrifree YM-30において遠心力1,100 g（1,110; 1,500; 2,000; 3,000; 4,000; 5,000; 10,000 gの7段階を検討）遠心時間30分（10分; 20分; 30分の3段階を検討）、設定温度37℃（25°C; 28°C; 31°C; 34°C; 37°Cの5段階を検討）の条件下で最も良好な値が得られた（pH 7.4-8.7の範囲内による変動は見られなかった）。この条件をもとに日内および日間変動を確認したところ、T4で6.1と7.7% 、T3で3.8と11%となり、遊離型THsの高精度測定法が確立された。現在、他の動物種による分析精度を確認しており順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
確立された遊離型THsの高精度機器分析法を用いて、数種の動物における血清中THs濃度を測定し、その精度から適用性を確認する。また、遊離型THsの測定には限外ろ過法だけでなく平衡透析法も有用性が高い可能性があるため、平衡透析(Equilibrium dialysis : ED)デバイスも検討する。さらに、エストロジェン、アンドロジェン、そしてコルチコイド系のステロイドホルモンについても、SPE処理とLC-MS/MS systemを用いて高精度の機器分析法を開発する。血中輸送タンパクであるsex hormone binding globulin (SHBG)やcorticosteroid binding globulin (CBG)との結合体とフリー体の分離は、甲状腺ホルモン分析と同様に、温度設定や処理時間など綿密な検討をおこなった後、最適なultrafiltration (UF)もしくはEDデバイスを選定する。
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| Causes of Carryover |
最終年度は、血清試料の前処理工程に必要な限外ろ過や平衡透析などの消耗品の購入が不可欠となる。また、ガラス器具や有機溶媒・試薬など化学分析に関わる物品も購入する。甲状腺ホルモンの定量に使用するAB SCIEX QTRAP 5500 LC-MS/MS systemは、高精度・超微量測定が可能な反面、性能を維持し安定稼働させるには消耗品部品の交換だけでなく分析部の定期的な調整費も必要であるため、本研究費を活用する計画である。さらに、研究成果を国内外の学会やシンポジウムで発表するための旅費や国際学術誌に論文として投稿する際の印刷費等にも使用する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
内因性ホルモン分析に必要な限外ろ過・平衡透析デバイス、ガラス器具、有機溶媒、試薬、測定機器のAB SCIEX QTRAP 5500 LC-MS/MS systemの安定稼働に不可欠な消耗品部品や分析部の定期的な調整費に本研究費を活用する。また、研究成果を国内外の学会やシンポジウムで発表するための旅費や国際学術誌に論文として投稿する際の印刷費等にも使用する計画である。
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[Journal Article] Organohalogens and their hydroxylated metabolites in the blood of pigs from an open waste dumping site in south India: association with hepatic cytochrome P4502015
Author(s)
Mizukawa, H., Nomiyama, K., Kunisue, T., Watanabe, M. X., Subramanian, A., Iwata, H., Ishizuka, M., Tanabe, S.
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Journal Title
Environmental Research
Volume: 138
Pages: 255-263
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Presentation] Contamination status of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats: Effects on thyroid hormones homeostasis2015
Author(s)
Yamamoto, Y., Nomiyama, K., Mizukawa, H., Takiguchi, M., Ishizuka, M., Kunisue, T. Tanabe, S.
Organizer
Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC) North America 36th Annual Meeting
Place of Presentation
Salt Lake City, Utah, USA
Year and Date
2015-11-01 – 2015-11-05
Int'l Joint Research
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