2014 Fiscal Year Research-status Report
enChIPによる遺伝子座特異的ヒストン修飾酵素複合体とエネルギー代謝機構の解明
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26560395
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
酒井 寿郎 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (80323020)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 生活習慣病 / エピゲノム / ヒストン修飾酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1-1． レトロウィルスベクターを用いたenChIP用CRISPR系の作製。ガイドRNAをデザインし、目的とする遺伝子座にdCAS9をターゲットさせる仕組の構築に成功した。未分化褐色脂肪細胞を用い、目的とする遺伝子座領域にガイドRNAを作製し、これらのウィルスベクターを発現させ、クロスリンクの後Flagタグでクロマチン免疫沈降 (ChIP) を行い、十分にこの領域のDNA濃縮が得られることを確認した。1-2. enChIP-Seq 法によるUcp1, Adrb1 遺伝子プロモーターと相互作用しているゲノム領域の網羅的同定。Ucp1やAdrb1は成熟褐色脂肪細胞に分化して十分量が発現してくる遺伝子である。そこで成熟脂肪細胞でenChIPを行うために、予備検討を行った。良好な濃縮が未分化前駆褐色脂肪細胞では得られたものの、脂質の蓄積した脂肪細胞に分化させると、タンパク質複合体解析や次世代シーケンサー解析に耐えうる十分な濃縮が得られなかった。1-3. enChIP-MS 法を用いたゲノム間相互作用を媒介する分子の同定。上述したとおり、脂肪滴を蓄積した脂肪細胞では現在十分な濃縮が得られず検討中である。
2． S265A 変異-JMJD1A ノックインマウスの作製： PKA によりリン酸化されるセリンをアラニンに変異させたマウスJMJD1a のコンストラクトの作製を進めノックインマウスを樹立した。現在順調に繁殖しており、寒冷刺激での低体温、肥満が起こるかなどの実験を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成26年には成熟褐色脂肪細胞でのenChIPを樹立する予定であったが、脂肪をため込まない前駆脂肪細胞でのみ系が確立している。一方ノックインマウス作製の計画はジェノタイピングから、予定通り進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
成熟脂肪細胞でのChIP効率が悪いのは、取り除けきれない脂肪が邪魔をしているのかも知れないが、使用しているプロモーターがLTRというウィルス由来の弱いプロモーターを使っていることも懸念される。よって、レンチウィルスを用いて、EF1などより強いプロモーターでドライブされるベクターを構築する。
一方で、分化させない前駆脂肪細胞ではFlagタグで目的とする遺伝視座にターゲットさせることは可能となった。前駆脂肪細胞において、脂肪細胞のマスターレギュレーター遺伝子上でDNA切断活性のないdCAS9を発現させ、enChIP-seq, enChIP-MSを樹立することが現実的によりハードルが低いのでこれを優先して行う。
さらに、DNA切断活性をもつ3xFLAG-Cas9-NLSを一過性に発現させ、すでに明らかにしてきたUcp1遺伝子の遠隔にある活性化領域を欠失させる細胞株を構築し、proof of concept を行う。実際にAdrb1の44kb上流のエンハンサー領域の遺伝子を2対欠失させることに成功した。Βアドレナリン刺激でより遺伝子発現上昇の見られるUcp1遺伝子13kb上流に新規に同定した活性のあるエンハンサー領域を欠失させるためにトランスフェクションをおこない、2対の遺伝子の双方ともにこの領域が欠失している細胞をFacsでGFPをマーカーにソーティングした後、2対の遺伝子も目的の場所で欠失された細胞を選択中である。
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[Journal Article] The FBXL10/KDM2B Scaffolding Protein Associates with Novel Polycomb Repressive Complex-1 to Regulate Adipogenesis2015
Author(s)
Inagaki T, Iwasaki S, Matsumura Y, Kawamura T, Tanaka T, Abe Y, Yamasaki A, Tsurutani Y, Yoshida A, Chikaoka Y, Nakamura K, Magoori K, Nakaki R, Osborne TF, Fukami K, Aburatani H, Kodama T, Sakai J.
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Journal Title
J Biol Chem
Volume: 290
Pages: 4163-4177
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] PPARβ/δactivation of CD300a controls intestinal immunity.2014
Author(s)
Tanaka T, Tahara-Hanaoka, Mabekura T, Ikeda K, Jiang S, Tsutsumi S, Inagaki T, Magoori T, Higurashi H, Takahashi H, Tachibana K, Tsurutani Y, Raza S, Anai M , Minami T, Wada Y, Yokote K, Doi T, Hamakubo T, Auwerx J, Gonzalez J, Nakajima A, Aburatani H, Naito H, Shibuya A, Kodama T, Sakai J.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 4
Pages: 4
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Direct Evidence for Pitavastatin Induced Chromatin Structure Change in the KLF4 Gene in Endothelial Cells.2014
Author(s)
Maejima T, Tanaka; T, Minami T, Hamakubo T, Ihara S, Sakai J, Nozaki N, Aburatani H, Ruan X, Tanabe H, Ruan Y, Endo A, Kodama T, Wada Y.
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Journal Title
PlOS One
Volume: 9
Pages: e96005
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] PKA dependent phospho-switch on JMJD1A regulates higher-order chromatin dynamics via SWI/SNF association for thermogenesis2015
Author(s)
Yohei Abe, Royhan Rozqie, Yoshihiro Matsumura, Takeshi Kawamura, Ryo Nakaki, Yuya Tsurutani, Kyoko Tanimura-Inagaki, Akira Shiono, Kenta Magoori, Kanako Nakamura, Shingo Kajimura, Hiroshi Kimura, Toshiya Tanaka, Kiyoko Fukami, Timothy F. Osborne, Tatsuhiko Kodama, Hiroyuki Aburatani, Takeshi Inagaki, Juro Sakai
Organizer
DEUEL Conference on Lipids
Place of Presentation
Monterey, California, USA
Year and Date
2015-03-04
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[Presentation] Role of Isocitrate Dehydrogenase 3 in Regulation of Epigenome and Transcription during Adipogenesis2014
Author(s)
Ariyanto, E.F., Matsumura, Y., Soga, T., Inagaki, T., Sakai, J.
Organizer
The 37th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
Place of Presentation
Pacifico Yokohama, Yokohama
Year and Date
2014-11-26
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